[发明专利]蛋白酶筛选方法及由此鉴别的蛋白酶

权利要求书

1.一种鉴别或选择裂解蛋白质靶底物中裂解序列的蛋白酶或其催化活 性部分的方法，其包括：

a)将包含多个突变体蛋白酶和/或所述突变体蛋白酶的催化活性部分的 集合与蛋白酶捕获多肽接触，其中

所述蛋白酶捕获多肽包含含有所述裂解序列的反应位点，其含有 P1-P1’易断裂键，

在所述蛋白酶捕获多肽的所述反应位点中包括的裂解序列中的P1-P1’ 易断裂键氨基酸由所述集合中的蛋白酶或其催化活性部分裂解时，所述蛋 白酶捕获多肽与所述蛋白酶或者其催化活性部分形成共价键以形成稳定的 含蛋白酶或其催化活性部分和蛋白酶捕获多肽的复合物；及

b)从所述集合的未复合的成员中分离复合的蛋白酶；及

c)鉴别或选择复合物中的蛋白酶或其催化活性部分以鉴别或选择裂解 所述蛋白酶捕获多肽中裂解序列的蛋白酶或其催化活性部分，从而鉴别或 选择裂解所述蛋白酶靶底物的蛋白酶或其催化活性部分。

2.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶捕获多肽选自丝氨酸蛋白酶抑 制蛋白、α-巨球蛋白家族成员、p35家族成员及其修饰形式。

3.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分的集合被修 饰以与未修饰的蛋白酶相比对于靶底物具有改变的活性和/或特异性。

4.权利要求1-3任一项的方法，其中：

标记所述蛋白酶捕获多肽用于检测或分离；及

分离通过捕获含有具有任何蛋白酶或其催化活性部分的可检测的蛋白 酶捕获多肽的复合物而进行。

5.权利要求4的方法，其中捕获在悬浮液、溶液或在固体支持物上进 行。

6.权利要求4的方法，其中所述蛋白酶捕获多肽用生物素标记。

7.权利要求1的方法，进一步包含扩增所述分离的复合物中的蛋白酶 或其催化活性部分，其中扩增包括在宿主细胞中表达编码所述蛋白酶或其 催化活性部分的核酸。

8.权利要求1的方法，其是多元的，其中

将多个不同的蛋白酶捕获多肽与所述集合接触；及

至少两种蛋白酶捕获多肽可以被可鉴别地检测，从而

鉴别复合物中一个以上的蛋白酶或其催化活性部分。

9.权利要求1的方法，其中所述复合物中蛋白酶或其催化活性部分被 展示，从而在鉴别或选择之后对编码所述蛋白酶的核酸进行扩增以产生蛋 白酶和/或其催化活性部分的第二个集合。

10.权利要求9的方法，进一步包括将所述第二个集合与第二种蛋白酶 捕获多肽接触以产生第二组稳定复合物，其中稳定复合物包含与蛋白酶或 其催化活性部分共价连接的蛋白酶捕获多肽。

11.权利要求10的方法，其中所述第二种蛋白酶捕获多肽与第一种蛋 白酶捕获多肽相同或不同。

12.权利要求10的方法，进一步包括鉴别或选择所述第二组稳定复合 物中的蛋白酶。

13.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分的集合包含 至少5、10、50、100、500、10³、10⁴、10⁵、10⁶或更多个不同成员。

14.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分是丝氨酸和 /或半胱氨酸蛋白酶。

15.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分在固体支持 物、细胞表面或者在微生物表面上被展示。

16.权利要求15的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分在酵母、 细菌、病毒、噬菌体、核酸、mRNA分子或者在核糖体表面上被展示。

17.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶或其催化活性部分在噬菌体展 示文库中被展示。

18.权利要求1的方法，其中所述蛋白酶以蛋白酶的催化活性部分提 供。