[发明专利]评价用靶向RET受体酪氨酸激酶的药物治疗的患者的方法

说明书

本发明涉及选择患者的方法，所述患者是采用RET药物治疗的候选者，由 此预测对RET药物反应的增加的可能性。本发明提供了一种测定RET序列的 方法。该方法提供了最优化用于测定RET序列的ARMS引物。本发明还提供 了包含ARMS引物的诊断试剂盒。

蛋白在酪氨酸残基上的磷酸化是细胞内信号转导的关键因素。能催化这种 反应的酶称作酪氨酸激酶。许多跨膜受体含有具有酪氨酸激酶活性的结构域， 并被归类为受体酪氨酸激酶(RTK)。RTK转导多种多样过程的胞外信号，所述 过程如细胞生长、分化、存活和程序性细胞死亡。响应胞外配体的结合，RTK 通常二聚化，从而导致自身磷酸化以及通过识别RTK的磷酸化形式并与之相互 作用的效应物的胞内信号转导。RTK家族有几个成员，其中之一为RET原癌基 因，其编码120kDa的蛋白RET(在转染过程中重排)。RET是胶质细胞衍生 的神经营养因子(GDNF)家族的生长因子受体。已鉴定了2个RET的配体GDNF 和neuturin(NTN)。当RET的配体结合共同受体且该复合物与RET相互作用时， RET被活化(Eng，1999 Journal Clinical Oncology.17(1)380-393)。

活化使得RET在酪氨酸残基上磷酸化，从而导致细胞生长和分化的信号通 过RAS-RAF和PI3激酶途径和其他可能的途径进行转导。

已知活化RET的点突变引起3种相关的显性遗传的癌症综合征：多发性内 分泌腺瘤2A型和2B型(MEN2A和MEN2B)以及家族性甲状腺髓样癌(FMTC) (Santoro等.2004 Endocrinology：145，5448-5451)。

在几乎所有的MEN2A病例和一些FTMC病例中，在胞外的近膜半胱氨酸 富集结构域具有半胱氨酸的置换，而95％的MEN2B病例是在激酶结构域的密 码子918的单个点突变(M918T)造成的。密码子918被认为位于催化核心的 底物识别口袋中。该位点的突变被认为改变了RET催化结构域活化环的结构， 进而组成型激活RET。M918T突变同样发现于偶发性髓样癌中，其中它与侵袭 性疾病表型相关。体外研究已表明，所述突变影响底物特异性，从而RET优选 通过非受体酪氨酸激酶诸如c-src和c-abl识别和磷酸化底物(Eng等.1996JAMA： 276，1575-1579；Ponder等1999 Cancer Research：59，1736-1741；Schilling等. 2001 International Journal of Cancer：95，62-66；Santoro等.1995 Science：267， 381-383；Zhou等1995 Nature：273，536-539)。

因为RET基因中的突变在大多数MEN2家族中已得到鉴定，所以分子诊断 测试是可能的，且可用于证实临床诊断。RET突变的测试可采用基于聚合酶链 反应的规程进行，其中扩增靶外显子序列用于直接测序或限制性内切核酸酶消 化(Zhong等2006 Clinica Chimica Acta：364，205-208)。

RTK家族的另一个成员是血管内皮生长因子受体2(VEGFR2(含激酶插入 结构域受体，KDR(也称FIk-1)))。VEGFR2是血管内皮生长因子(VEGF)的受体。 VEGF被认为是正常和疾病相关的血管发生(Jakeman，等1993 Endocrinology： 133，848-859；Kolch，等.1995 Breast Cancer Research and Treatment：36，139-155)和 血管通透性(Connolly，等.1989 J.Biol.Chem：264，20017-20024)的重要刺激物。 通过用抗体螯合VEGF拮抗VEGF作用可导致抑制肿瘤生长(Kim，等.1993 Nature：362，841-844)。VEGF基因的杂合破坏导致血管形成的致命缺陷(Carmeliet， 等.1996 Nature 380：435-439；Ferrara，等.1996 Nature 380：439-442)。