[发明专利]小而密低密度脂蛋白中的胆固醇的定量方法

说明书

技术领域

本发明涉及样品中的小而密低密度脂蛋白(以下简记为sdLDL)中的胆固醇(以下简记为sdLDL-C)的定量方法以及定量用试剂盒。 

背景技术

血液中存在的脂蛋白根据其比重大致分为高密度脂蛋白(以下简记为HDL)、低密度脂蛋白(以下简记为LDL)、极低密度脂蛋白(以下简记为VLDL)以及乳糜微粒(以下简记为CM)4类。构成各脂蛋白的脂质组成也不同，并且，根据构成各脂蛋白的载脂蛋白的种类的不同，在生物体中的作用大不相同。另外，作为在从VLDL到LDL代谢的过程中所生成的脂蛋白，存在密度在VLDL和LDL中间的中间密度脂蛋白(以下简记为IDL)，其在广义上也被分类为LDL。 

临床检查中，作为动脉硬化诊断的筛选指标，使用总胆固醇、总甘油三酯、HDL胆固醇、LDL胆固醇、载脂蛋白AI、载脂蛋白B等。其中，被认为与动脉硬化形成紧密相关的LDL胆固醇已经开始被频繁地测定。另一方面发现，很多人尽管LDL胆固醇不高，但也具有冠动脉硬化病变。也有报道称：在该病症中，小而高密度的LDL(该LDL称为sdLDL)增加，sdLDL-C与冠动脉疾病的相关程度在LDL-C以上[参照“ア一テリオスクレロ一シストロンボシスアンドヴアスキユラ一バイオロジ一(Arteriosclerosis Thrombosis，and Vascular B iology)”，2004年，第24卷，p.558-563]。 

作为测定sdLDL的方法，已知有电泳法、超速离心法、分级沉淀法等。电泳法是使用2～16％的非变性梯度凝胶进行电泳、染色来测定LDL颗粒尺寸的方法，但操作繁杂，通用性差。另外，在该方法中虽 然能够测定LDL的颗粒尺寸，但不能进行sdLDL的定量。此外，有通过离子强度的差使sdLDL混悬或溶解、再通过吸光度的差来测定sdLDL的方法(参照专利文献1)。但是，该方法中由于对浊度进行测定，因此特异性和精度不充分，并且，该方法中虽然能够测定sdLDL量，但不能测定sdLDL-C。 

对sdLDL-C进行定量的方法有超速离心法、分级沉淀法等。超速离心法是使用超速离心分离机分离提取出样品中相当于sdLDL的比重区域并测定该比重区域中的胆固醇的方法，能够作为sdLDL-C定量的标准方法。但是，该方法需要昂贵的设备，测定需要非常长的时间，且需要技术上熟练。 

分级沉淀法为如下方法：在第一步骤中，使用聚阴离子与2价阳离子或1价阳离子的组合、或者聚乙二醇，使样品中的HDL和sdLDL以外的脂蛋白聚集，通过离心分离或过滤器过滤除去聚集物，分离出HDL和sdLDL；在第二步骤中，对分离得到的含有HDL和sdLDL的试样中的sdLDL-C进行定量(参照专利文献2)。该方法比超速离心法操作简便，但由于需要进行分级沉淀操作，因此测定上需要时间。 

许多文献报道有如下方法：在表面活性剂存在下，使胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或胆固醇脱氢酶特异性地作用于选自HDL、LDL、VLDL及CM中的一种或多种特定脂蛋白，来测定要测定的脂蛋白中的胆固醇。近来，报道了一种sdLDL-C的定量法，其特征在于，在聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物的存在下，向样品中添加胆固醇测定用酶，使聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或其衍生物选择性地作用于sdLDL，并测定所生成的胆固醇的量(专利文献3)。 

专利文献1：日本特开2003-28882号公报 

专利文献2：国际公开第2004/053500号小册子 

专利文献3：国际公开第2007/026829号小册子 

发明内容

本发明的目的在于提供能够简便且准确地对样品中的sdLDL-C进行定量的方法及试剂盒。 

本发明涉及下述[1]～[12]。 

一种样品中的sdLDL-C的定量方法，包括下述步骤(i)、(ii)和(iii)： 

步骤(i)：在含有表面活性剂A的反应液中，使该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶、或者该胆固醇酯水解酶、该胆固醇脱氢酶和氧化型辅酶作用于样品，除去该样品中的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及LgLDL-C，其中，所述表面活性剂A为与由胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶或者胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的HDL-C、VLDL-C、CM-C以及LgLDL-C的反应相比优先抑制由该胆固醇酯水解酶和该胆固醇氧化酶或者该胆固醇脱氢酶-氧化型辅酶引起的sdLDL-C的反应的表面活性剂；