[发明专利]提高真菌细胞中基因表达的方法

说明书

发明背景

发明领域

本发明涉及提高真菌细胞中编码多肽的基因的表达的方法。

相关技术描述

在真菌宿主细胞(例如酵母或丝状真菌细胞)中重组产生天然或外源多肽可以为以商业相关量制备多肽提供更理想的运载体(vehicle)。

天然或外源多肽的重组产生通常通过构建表达盒(expression cassette)来完成，在所述表达盒中将编码所述多肽的DNA置于启动子的表达调控之下，该启动子来自一种受调节的基因。通常通过质粒介导的转化将表达盒引入宿主细胞。然后通过在使表达盒中所含启动子正确发挥功能所必需的诱导条件下培养受转化的宿主细胞来实现多肽的产生。

用于在真菌宿主细胞中重组产生多肽的新表达构建体和载体的开发通常要求高效启动子的可用性，所述高效启动子适合用于在所述宿主细胞中调控所述多肽的表达。然而，即使是最广为人知的启动子对于表达感兴趣的基因也可能是低效的(inefficient)。

许多启动子对于受到的能够提高它们的效率的调节是敏感的。指名为CUP1的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)金属硫蛋白基因由铜通过特异性启动子区UAS_CUP1(上游激活序列)转录激活，据报道UAS_CUP1位于相对于CUP1转录激活位点的-105和-230之间(Thiele和Hamer，1986，Mol.Cell.Biol.6：1158-1163；Zhou和Thiele，1993，Biofactors 4：105-115)。酿酒酵母的Ace1蛋白(Acelp)负责在铜离子(Thiele，1988，Mol.Cell.Biol.8：2745-2752)或银离子(Furst等，1988，Cell 55：705-717)的存在下诱导酵母金属硫蛋白基因CUP1。Acelp氨基末端的一半富含碱性氨基酸残基和半胱氨酸，并且在Cu(I)或Ag(I)存在下与CUP1上游激活序列特异性地结合，而在不存在Cu(I)或Ag(I)时则不与CUP1上游激活序列特异性地结合(Furst等，1988，见上文)。Thiele和Hamer，1986，Molecular and Cellular Biology 6：1158-1163公开了串联重复上游调控序列(tandemly duplicated upstream control sequences)介导酿酒酵母铜-金属硫蛋白基因的铜诱导型转录，并且这些元件之一的合成形式(syntheticversion)当以两个串联拷贝存在时为异源启动子赋予铜诱导性。

Gralla等，1991，PNAS USA 88：8558-8562公开了Acelp激活酵母铜、锌的超氧化物歧化酶基因的表达。Lapinskas等，1993，Current Genetics 24：388-393公开了Acelp激活酿酒酵母胞质过氧化氢酶基因的表达。

Mehra等，1989，J.Biological Chemistry 264：19747-19753描述了对来自光滑念珠菌(Candida glabrata)金属硫蛋白基因的克隆和该基因的序列。Zhou和Thiele，1991，PNAS USA 88：6112-6116描述了来自光滑念珠菌的由金属激活的转录因子基因的分离。Thorvaldsen等，1993，J.Biological Chemistry 268：12512-12518公开了通过AMT1对指名为MTI、MTIIa和MTIIb的光滑念珠菌金属硫蛋白基因的调节。

Mascorro-Gallardo等，1996，Gene 172：169-170公开了调节酿酒酵母中基因表达的基于CUP1启动子的载体的构建。Macreadie等，1989，Plasmid 21：147-150公开了一系列利用酿酒酵母CUP1基因的酵母表达载体。Hottiger等，1994，Yeast 10：283-296公开了CUP1启动子的生理学特征和过表达它的转录激活子Acelp的后果。

本发明的一个目的是提供改进的在真菌宿主细胞中产生多肽的方法。

发明概述