[发明专利]双歧杆菌中的遗传重建

权利要求书

1.双歧杆菌细胞，其包含经定制的从而缺乏有效功能基因的基因组， 其中该功能基因是tetW并且其中所述双歧杆菌细胞缺乏tetW基因的核酸 序列。

2.权利要求1的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌细胞。

3.权利要求2的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种细胞。

4.权利要求1的双歧杆菌细胞，其为动物双歧杆菌乳酸亚种菌株 NCC9034。

5.权利要求1的双歧杆菌细胞，其与含有有效tetW基因的对照细胞 相比对四环素更敏感至少5倍。

6.权利要求5的双歧杆菌细胞，其与含有有效tetW基因的对照细胞 相比对四环素更敏感至少10倍。

7.权利要求6的双歧杆菌细胞，如利用平板扩散试验所测定，其对高 于0.3微克每毫升的四环素浓度敏感。

8.动物双歧杆菌的培养物，其包含权利要求1的细胞。

9.生产缺乏有效的预定功能基因的双歧杆菌细胞的方法，其中所述功 能基因是tetW并且提供对抗生素增加的抗性，所述方法包括步骤：

从双歧杆菌中获得预定功能基因的上游和下游序列；

用在双歧杆菌中不复制的质粒转化双歧杆菌细胞群体，所述质粒包含 功能基因的上游和下游侧翼序列和编码选择性标记的基因；

在允许含有编码质粒中选择性标记的基因的细胞生长、但那些不具有 编码所述选择性标记的基因的细胞不能生长的条件下培养所述双歧杆菌细 胞，从而选择含有整合质粒的转化体；

在非选择性条件下培养转化体，所述条件允许细胞的生长但允许整合 质粒的丢失；

通过在具有和不具有选择压力的平板上影印培养菌落并选择那些对选 择压力敏感的菌落来选择已失去所整合质粒的细胞；

确认对选择压力敏感的细胞不再具有所述功能基因的功能，从而产生 缺乏有效预定功能基因的双歧杆菌细胞。

10.权利要求9的方法，其中所述预定的功能基因被缺失。

11.权利要求9的方法，其中所述抗生素是四环素。

12.权利要求9的方法，其中所述选择压力是抗生素的存在。

13.权利要求12的方法，其中所述抗生素是大观霉素。

14.权利要求9的方法，其中所述质粒通过同源重组整合进基因组。

15.权利要求14的方法，其中所述整合的质粒通过第二次同源重组而 丢失。

16.权利要求10或14的方法，其中缺失或致使失效的唯一的功能基 因是所述预定的功能基因。

17.权利要求16的方法，其中在非选择条件下培养转化体至少100代。

18.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是长双歧杆菌细胞或动物 双歧杆菌细胞。

19.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种 细胞。

20.权利要求9的方法，其中双歧杆菌细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种 NCC2818，且所获得的细胞是动物双歧杆菌乳酸亚种NCC9034。