[发明专利]半乳糖基转移酶

说明书

本发明涉及编码糖基转移酶的多核苷酸。此外，本发明涉及其部 分多核苷酸以及包含这些多核苷酸的载体，用于其表达或基因破坏的 目的，涉及用所述多核苷酸或其部分或衍生自其的DNA转染的重组宿 主细胞、组织或生物，以及在这些宿主细胞、组织或生物中产生的糖 蛋白。此外，本发明涉及其表达产物在体外以及体内的用途。

过去，使用多种转化的细胞系统，如由细菌、真菌(如酵母)、 昆虫、植物或哺乳动物细胞系的那些细胞系统产生的异源蛋白。

在原核生物中产生的蛋白质不能以与真核系统中产生的真核生物 蛋白相似的方式进行翻译后修饰，即，它们不能在特定氨基酸残基如 天冬氨酸(N)残基处用合适的糖进行糖基化(N-连接的糖基化)。此 外，由于，例如细菌不能形成半胱氨酸二硫键，细菌产生的真核生物 蛋白的折叠可能是不合适的。此外，细菌产生的重组蛋白经常作为不 溶性包含体聚集和积累。

真核细胞系统更好地适于产生在多种真核生物如人类中发现的糖 基化蛋白质，因为这种细胞系统可以实现所产生蛋白质的翻译后修饰， 如N-糖基化。然而，在用适于产生用作例如药物的蛋白质序列的异源 基因转化的真核细胞系统中遇到的一个问题是此类蛋白质上的糖基化 模式通常获得天然模式，即产生该蛋白质的真核细胞系统的模式：产 生的糖基化蛋白质包含非动物糖基化模式并且这些非动物糖基化模式 如果应用于包括人的动物中又可以是免疫原性和/或变应原性的。在植 物中，已经通过消除植物特异性糖残基1，2-木糖和α1，3-岩藻糖克服 了该限制，所述1，2-木糖和α1，3-岩藻糖在植物中通常连接到N-聚糖 的核心结构(Lerouge等人，1998 Plant Mol.Biol.38，31-48；Rayon 等人，1998 J.Experimental Bot.49，1463-1472)。在拟南芥 (Arabidopsis thaliana)(Strasser等人，2004 FEBS Lett.561， 132-136)和苔藓类小立碗藓(Physcomitrella patens)(EP1431394； Koprivova等人，2004 Plant Biotechnol.J.2，517-523)的情况 下，产生了显示完全缺少核心α1，3-岩藻糖和1，2-木糖残基的N-聚糖 模式的突变体。令人惊奇地，尽管进行了完全类型的N-聚糖模式的修 饰，但是在这些突变体中没有观察到形态学改变或存活力的改变。

除了加入上述两个植物特异性残基外，取决于GlcNAc-转移酶I、 GlcNAc-转移酶II和高尔基体a-甘露糖苷酶的作用，在植物和哺乳动 物中内质网和顺面高尔基体中糖蛋白成熟的步骤是相同的(Lerouge 等人，1998 Plant Mol.Biol.38，31-48)。在这两个界中，进一步 的N-聚糖延长以不同的方式进行。尽管在哺乳动物中，末端GlcNAc 残基立即被β1，4-(或偶尔β1，3-)-半乳糖基转移酶作用的屏蔽- IgG显著除外(该步骤仅仅部分发生)-在植物中的延长仅仅通过β 1，3-半乳糖基化作用，但是仅仅非常小部分的聚糖似乎经历该修饰， 如可以从多种结构类型的相对丰度推导出。哺乳动物中的半乳糖残基 可以被唾液酸加帽并且仅仅相当罕见地被岩藻糖取代。再次，植物是 不同的，因为它们没有唾液酸化并且在连接末端1，3-连接的半乳糖残 基的情况下，它们基本上总是岩藻糖化倒数第二位的GlcNAc残基，从 而形成路易斯a(Lewis a)(LeA)决定簇。显然，β1，3-半乳糖基转 移酶是限速酶，而多数植物细胞含有足够的α1，4-Fuc-转移酶活性以 确保含有触角的每个Gal被岩藻糖基化。LeA结构是人血型决定簇。 它在健康成年人中是罕见的，但是作为唾液酸基-路易斯a(sLeA)， 它被众所周知地发现于恶性组织如结肠癌中。

无论如何，含有糖蛋白的LeA很少从植物分离并且在立碗藓属 (Physcomitrella)的情况下，它们以多至总的可溶性糖蛋白的5％ 的量存在-不管从野生型植物分离还是从缺少核心岩藻糖和木糖的糖 改造的突变体分离(Koprivova等人，2003 Plant Biol.5，582-591； Koprivova等人，2004 Plant Biotechnol.J.2，517-523)。