[发明专利]活牛痘疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于制备含有减毒痘苗病毒作为有效成分的活牛痘 疫苗的方法，所述病毒在增殖的同时即时产生回复体。更具体而言， 本发明涉及制备活牛痘疫苗的方法，该方法包括以下步骤：将含有减 毒痘苗病毒的主种子溶液接种至适当数量组(1～n，其中n是整数)的 兔肾细胞的容器内，将其培养；将每个容器内的一部分培养液接种至 RK-13细胞和Vero E6细胞中，将其培养，从而选择装有在RK-13细 胞中形成噬斑但在Vero E6细胞中不形成噬斑的培养液的容器，收集 选择容器内所得的各种培养液；用上述收集的培养液(工作种子溶液) 制备疫苗原液。以及涉及通过上述制备方法获得的活牛痘疫苗。

背景技术

天花也称为牛痘，曾经是人们最恐惧的一种病毒性传染病。分类 为正痘病毒属的病毒(包括天花病毒)具有长度为约180～200kbp的基 因组，其中心部分具有约100kbp的区域，在分类为正痘病毒属的病 毒中高度保守。因为该区域编码保护性抗原，所以分类为正痘病毒属 的病毒之间表现几乎完全交叉免疫(参阅如非专利文献1)。通常，将致 病性病毒衍生的减毒株用于制备活疫苗。但是，在牛痘疫苗(天花疫苗) 的情况下，使用的不是牛痘病毒衍生的病毒，而是痘苗病毒，通常是 Lister株、New York City Board of Health株(下文也称为“NYCBH株”)、 Dairen株、Ikeda株等。

在日本，已经使用用具有通过将Lister株或Dairen/Ikeda株接种 至牛产生的小囊泡的牛皮肤组织制备的牛痘疫苗。这些疫苗已导致严 重的不良反应，如婴儿接受第一次接种后的接种后脑炎，发病率为一 百万例中数人发病(参阅如非专利文献2)。它们不是无菌的，因为用牛 进行繁殖和传代，所以包含未纯化的病毒。因此，Hashizume等制备 来源于Lister株的温度敏感性减毒病毒株，使病毒适应于兔肾的初级 细胞和较低温度。最终，从克隆中选择在鸡卵的尿囊绒膜中形成小痘 疱的LC16m8株并纯化。1975年在日本经过临床试验后LC16m8株得 到批准(参阅如非专利文献3)。虽然减毒痘苗病毒LC16m8株的神经 毒性比其母株Lister株或NYCBH株(是美国批准的牛痘疫苗Dryvax 的母株)低很多(参阅如非专利文献3和4)，但是LC16m8株诱导的中 和抗体水平与Lister株诱导的水平几乎相当(参阅如非专利文献5)。而 且，只有LC16m8株被批准作为在细胞培养中制备的减毒牛痘疫苗。

选择LC16m8株作为病毒，该株在低温下从其母株LC16mO株 传代3次后形成小痘疱，将其克隆。已经显示形成此类小痘疱的原因 是B5R基因中移码突变导致的B5R蛋白缺乏(参阅如非专利文献6)。 据报道，因为B5R蛋白是分类为正痘病毒属的病毒的细胞外膜的主要 组成蛋白，所以这种蛋白缺乏可导致病毒感染对附近细胞的功效下降 从而形成小痘疱(参阅如非专利文献7)。

另一方面，因为B5R蛋白缺乏是由于B5R基因中单核苷酸缺失， 所以比较容易出现LC16mO-型的返祖(回复体)株(参阅如非专利文献 8)。对这些回复株的B5R基因的核苷酸序列进行分析，显示了B5R 的ORF读码框回复，因为核苷酸274G附近出现单核苷酸的重复、4 核苷酸的重复或2核苷酸的缺失。当比较生物学特性时，回复株形成 的噬斑小于LC16mO株的噬斑但大于LC 16m8株在RK-13细胞和Vero E6细胞中形成的噬斑。它们在鸡胚卵尿囊绒膜上也形成大小与 LC16mO的相等的痘疱。当回复体含量比达到约4％时，病毒在兔皮 肤中的增殖力与在人皮肤中的增殖力无明显差异。同时，假定了回复 体含量比高于上述比率时增殖力有显著差异(参阅如非专利文献9)。

非专利文献1：Moss，B.2001.Poxviridae：the Viruses and their replication(痘病毒科：病毒及其复制)，2849～2883页.In D.M.Knipe and P.M.Howley(ed.)，Fields virology，第4版，2卷.Lippincott/The Williams & Wilkins Co.，Philadelphia，Pa.