[发明专利]产生用于生物分析的冷冻血或冷冻血细胞的方法

说明书

本发明涉及在-40℃至-60℃的温度下、优选在-50℃至-60℃下，低 温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血或血细胞的改进的方法，由此 单核细胞(monocyte)和淋巴细胞的功能得到保存。本发明特别涉及在不需 要分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的 情况下，低温保存含有单核细胞和淋巴细胞的人全血或血细胞的方法。

发明背景

为了临床检查针对受细胞介导的免疫性(即接种个体的细胞免疫状态) 抵抗的病原体的疫苗，通常从接种个体的血液样品中分离单个核细胞。 为此，需现场装备高度专业化的实验室以及具有相应资格的工作人员。 而且，所有的容器和试剂必须是无热原的。通常，将细胞在液氮(通常为 气相)中冷冻、储藏并装运。

通常，在发展中国家(如在非洲)进行上述临床检查。现场装备专门化 的实验室、招募合适的工作人员以及运输液氮中的样品，都需要高昂的 资金和高超的技术。而且，在无热原的条件下分离单个核细胞易受外界 的影响，热原物质可能激活单核细胞，这使得样品无价值。

低温保存的血液或血细胞也被认为是基于人的发热反应的可选择热 原检测中的基本工具。简而言之，将待测量的样品在加热的情况下与人 血液或血细胞一起温育，其后，评估作为单核细胞激活指示剂的促炎细 胞因子的产生。这个步骤也可以用新鲜抽取的人血液进行，但是作为一 条准则，即用型以及充分地表征的血液或血细胞是标准化和市场分配所 需的。

Lakey等(Lakey JR，Anderson TJ，Rajotte RV.Novel approaches to cryo-preservation of human pancreatic islets(低温保存人胰岛的新方法). Transplantation.2001 Sep 27：72(6)：1005-11)记载了具有标准低温保护剂 二甲亚砜(DMSO)的乙二醇(EG)对分离的人胰岛存活和功能的低温保护 作用。结果证明，与2.0M的DMSO和各种浓度的EG相比，较低浓度 的DMSO(1.5M)可使人胰岛的低温保存具有较好存活以及对培养后功能 的保存。

人全血分析日益用于检测免疫功能或检测热原污染，这是因为它们 提供了诸如便于操作、制备假象少以及生理细胞环境等优点。然而，该 方法经常受到新鲜抽取的血液的利用率、在被感染供体情况下的推断的 安全性顾虑、以及个体间供体差异的限制。

EP 0741294 B1记载了通过与全血接触和随后测量内源性热原的产 生检测化合物的热原活性的方法。但没有记载血液的低温保存。

Schindler等(Schindler S，Asmus S，von Aulock S，Wendel A，Hartung T， Fennrich S.Cryopreservation of human whole blood for pyrogenicity testing (低温保存人全血用于热原性检测).J Immunol Methods.2004 Nov； 294(1-2)：89-100)记载了批量产生低温保存的血液的方法，所述血液在解 冻后可以直接使用而不需任何洗涤步骤。如通过FACS分析所显示的， 单个核细胞保持完整。细胞因子的释放可通过多种免疫学刺激进行诱导。 与新鲜的血液相比，细胞制剂释放更高量的白介素-1β(IL-1β)和IL-6，但 无TNF。通过向新鲜血液中加入低温保护剂二甲亚砜(DMSO)，可将这些 差异仅归因于DMSO的存在。大批量低温保存的血液可通过混合最多10 位供体的血液捐赠品制备，而不依赖对血型的区分。有关诱导IL-1β释放 的世界卫生组织(WHO)的脂多糖(内毒素，LPS)参考制品(EC-6)的检查限 度是至少0.5个内毒素当量(EU)/ml。可以以一系列药物检测欧洲药典规 定的极限浓度下的内毒素标样，表明体外热原检测(IPT)也可用低温保存 的血液进行。描述了其他可能的应用，包括高通量筛选免疫调节剂或毒 素以及保存患者的样品用于稍后的单核细胞功能分析。