[发明专利]突变型DNA聚合酶及相关方法

权利要求书

1.一种DNA聚合酶，其在聚合酶结构域中包含至少下列基 序：

SEQ ID NO：32所示的T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N,其中 X_b7是氨基酸S；并且X_b8是氨基酸G，

其中所述DNA聚合酶选自：

(a)CS5DNA聚合酶；

(b)CS6DNA聚合酶；

(c)海栖热袍菌DNA聚合酶；或

SEQ ID NO：32所示的T-G-R-L-S-S-X_b7-X_b8-P-N-L-Q-N,其中 X_b7是氨基酸S；并且X_b8是选自G,T,R,K或L的氨基酸，

其中所述DNA聚合酶是栖热菌种Z05DNA聚合酶；

其中所述CS5DNA聚合酶、所述CS6DNA聚合酶、所述海 栖热袍菌DNA聚合酶和所述栖热菌种Z05DNA聚合酶相对于X_b8是氨基酸D而其他方面相同的DNA聚合酶具有改良的核酸延伸速 率和／或改良的逆转录效率。

2.权利要求1的DNA聚合酶，其中位点X_b8的氨基酸是G。

3.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是SEQ  ID NO：15的CS5DNA聚合酶或SEQ ID NO：16的CS6DNA聚合 酶，而且第640位氨基酸是G。

4.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶是SEQ  ID NO：6的Z05DNA聚合酶，而且第580位氨基酸选自由G、T、 R、K和L组成的组。

5.权利要求1的DNA聚合酶，其中所述聚合酶包括嵌合的 聚合酶，其中所述嵌合的聚合酶相对于SEQ ID NO：18或SEQ ID  NO：19包含一个或更多个选自由下列氨基酸取代组成的组的氨 基酸取代：G46E、L329A、Q601R、D640G、I669F、S671F和 E678G。

6.权利要求1的DNA聚合酶，其进一步包含热可逆共价修 饰。

7.权利要求6的DNA聚合酶，其中所述包含热可逆共价修 饰的聚合酶由热稳定DNA聚合酶和具有选自下列的通式的二羧 酸酐的混合物在碱性pH和低于25℃的温度下进行的反应产生：

(a)式I：

其中R₁和R₂是氢或有机基团，和

(b)式II：

其中R₁和R₂是有机基团，且氢是顺式的。

8.权利要求7的DNA聚合酶，其中式I和／或式II中的R₁和R₂连在一起。

9.编码根据权利要求1的DNA聚合酶的重组核酸。

10.包含权利要求9的重组核酸的表达载体。

11.包含权利要求10的表达载体的宿主细胞。

12.一种生产DNA聚合酶的方法，所述方法包括：在适合编 码DNA聚合酶的核酸表达的条件下培养权利要求11的宿主细胞。

13.一种实施引物延伸的非诊断方法，包括：

在适合引物延伸的条件下使权利要求1的DNA聚合酶与引 物、多核苷酸模板和游离核苷酸相接触，从而产生延伸的引物。

14.权利要求13的方法，其中所述多核苷酸模板是RNA。

15.权利要求14的方法，其中所述适合延伸的条件包含 Mg²⁺和Mn²⁺。

16.根据权利要求13的方法，其中所述游离核苷酸包括非常 规核苷酸。