[发明专利]植物无选择转化

说明书

发明背景 

本申请要求于2006年8月31日申请的美国临时申请顺序号60/841,519的优先权，该临时申请所公开的全部内容都通过引用结合到本文中。 

1.发明领域 

本发明涉及植物生物技术领域。具体地讲，本发明涉及产生转基因植物的方法，该方法在得到再生植物或植物部分之前无需使用选择标记基因。 

2.相关技术的描述 

植物细胞的稳定转化和转基因植物的产生通常需要选择步骤，其中在接触一个或多个外源核酸序列(包括含有一个或多个编码目标基因和标记基因的序列的外源核酸序列)后，在选择剂存在下选择植物组织。经过这样的选择后，可使含有目标基因(GOI)的稳定转化植物再生并进行鉴定。然而，一旦产生含有GOI的转化植物后，通常就不再需要本身并非GOI的可选择或可筛选的标记基因，而且其存在可能使后续分析和产品开发工作变得复杂化。此外，需要强启动子以驱动选择标记，已经显示出会偏倚所需基因的表达(Yoo等，2005)。 

已经报道了产生无标记基因的转基因植物的各种方法，例如共转化、可转座元件、位点特异性重组和染色体内重组(例如Darbani等，2007)。然而，这些系统大部分既耗时又低效。Goldsbrough(2001)综述了在转基因植物的产生中避免使用或排除选择标记基因的方法。 

De Vetten等(2003；和美国专利申请公布说明书2005/0097641) 描述了营养体繁殖作物(例如马铃薯)的无标记转化方法，然而会产生嵌合植物。Palys等(PCT公布说明书WO2004/081184)介绍了番茄、莴苣和甘蓝的无选择转化。Francis和Spiker(2005)介绍了用基于PCR的筛选来鉴定转基因拟南芥(Arabidopsis)系，以免转基因整合中的选择偏倚。相比之下，本发明提供通过在获得再生玉米植物之前不需要存在选择剂或可筛选标记基因(例如目测标记基因)的方法而快速有效产生种系转化玉米植物的方法。 

发明概述 

一方面，本发明提供转基因玉米植物的鉴定方法，所述方法包括：(a)获得用含有目标核酸序列的DNA区段转化的玉米植物细胞；(b)不经过测定所述DNA区段存在的初次筛选，就从所述细胞再生出多个玉米植株或分化的玉米植物部分；和(c)从多个玉米植株或分化的玉米植物部分中鉴定出至少第一转基因玉米植物或转基因分化植物部分。在一些实施方案中，DNA区段不包含选择标记基因或目测标记基因。在其它实施方案中，植物在固体培养基、液体培养基或者固体与液体培养基组合上生长而得以再生。在具体的实施方案中，植物通过接触GOI之后仅在液体培养基上生长的细胞、而在鉴定转基因玉米植物或转基因分化植物部分之前就得以再生。在某些实施方案中，将接触GOI之后仅生长在液体培养基中的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率，与接触GOI之后在固体培养基或土壤上生长的细胞、而在鉴定转基因植物或转基因植物部分之前的细胞转化频率进行比较，前者相对更高。 

在某些实施方案中，植物细胞是未成熟的玉米胚细胞。在具体的实施方案中，未成熟玉米胚的长度约1.5mm至约3.5mm，或长度约1.9mm至约2.3mm。 

在某些实施方案中，所述方法在步骤(b)与(c)之间还包括(1)将多个玉米植物或分化的植物部分放入装有生长培养基或水的培养管或生长穴盆(growth plug)中并保留玉米植物各自的识别标记；和(2)让植物或植物部分经历至少第一测定，看DNA区段是否存在，从而根据测定结果来鉴定一个或多个植物或植物部分是转基因的。测定还可选自DNA印迹杂交、PCR、DNA测序、RNA印迹、蛋白质印迹、免疫测定和DNA区段所编码的酶活性测定。在具体的实施方案中，在将再生植株植入土壤之前进行测定。在其它实施方案中，鉴定推定缺乏目标核酸序列的转化玉米植物或分化的植物部分，其中在包含汇集所述多个玉米植物或分化的植物部分的合并核酸亚类的植物组织上进行测定。 

在一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于6周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于4周使玉米植物或玉米植物部分再生。在又一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于3周使玉米植物或玉米植物部分再生。在再一些实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于2周使玉米植物或玉米植物部分再生。在其它实施方案中，在DNA区段转化到玉米植物细胞后不迟于1周使玉米植物或玉米植物部分再生。