[发明专利]用于制备血管生成素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，以及涉及这类级分用作食品添加剂、营养制品或者用于制备治疗用组合物的用途。 

背景技术

血管生成素是一种由几类生长型细胞生产的14kDa、非糖基化的多肽，所述细胞包括血管内皮细胞、主动脉平滑肌细胞、成纤维细胞以及一些肿瘤例如结肠癌、卵巢癌和乳癌。已经从许多来源中分离出了血管生成素，包括正常人血浆、牛血浆、牛乳，以及小鼠血清、兔血清和猪血清。 

血管生成素与胰核糖核酸酶同源并且具有不同的核糖核酸酶活性。该蛋白质能够诱导新的血管生长；然而，尚未确认血管生成素的核糖核酸酶活性在该蛋白所诱导的血管发生中所起的作用。 

正常人血浆中血管生成素的浓度为60-120ng/ml。然而，该蛋白的浓度在患有各种癌症的患者体内会有所升高，并且已知抑制血管生成素可防止人肿瘤生长。 

除作为血管发生的有效刺激剂之外，血管生成素已经被证明具有许多其他活性。这些包括下列能力：移除皮肤缺陷例如色斑、调节免疫应答、保护多形核白细胞免于自发降解和抗全身性细菌和真菌病原体的杀微生物活性。基于已知的血管生成素的生理功能，可以预测该蛋白在药品、膳食食品添加剂和化妆品中的各种应用。 

然而，血管生成素在这类应用中的使用需要一种用于从适合来源以商业规模制备该蛋白的有效方法。本发明的一个优选实施方案的目标为提供这类方法。该方法还可能被包括在一种用于纯化其他乳制品组分(例如乳铁蛋白、乳酸过氧化物酶或生长因子)的现有的方法中作为其一部分。 

本说明书中所引用的所有参考文献——包括任何专利或专利申请——均通过引用的方式纳入本文。应该清楚地理解，尽管本文引用了许多现有技术出版物，但是这种引用并非承认任何这些文献在澳大利亚或在任何其他国家中构成本领域中的公知常识。 

发明内容

第一方面中，本发明提供了一种用于从乳制品中制备富含血管生成素的级分的方法，其中所述方法包括： 

(a)使所述乳制品与阳离子交换树脂接触； 

(b)用0.30-0.38M(1.75-2.25％w/v)氯化钠或等价离子强度的流动相将不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分从所述阳离子交换柱上洗脱下来； 

(c)用流动相将所述富含血管生成素的级分从所述阳离子交换树脂上洗脱下来；和 

(d)收集所述洗脱的富含血管生成素的级分， 

其中在步骤(a)之前或步骤(c)之后所述乳制品没有进行过阳离子交换色谱法处理。 

所述乳制品可包括全乳、脱脂乳、酪乳、乳清或初乳。与所述阳离子交换树脂接触的乳制品的量优选地为约16个柱体积(CV)至约600CV，更优选约16CV至约150CV，并且最优选约68CV。 

优选地，所述不含血管生成素的乳酸过氧化物酶级分是使用含有0.34M氯化钠(2.0％w/v)或具有等价离子强度的流动相洗脱的，并且所述流动相的pH为6.5。 

在所述第一方面的另一个实施方案中，优选在洗脱所述富含血管生成素的级分之前，将所述阳离子交换树脂用低离子强度的缓冲液(＜0.34M的盐或其等价物)或水冲洗以移除所述柱中剩余的乳制品。 

在所述第一方面的另一个实施方案中，洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相优选地含有0.38-1.5M氯化钠(2.25-8.7％w/v)或具有等价离子强度，更优选含有0.38-0.59M氯化钠(2.25-3.5％w/v)或具有等价离子强度，并且最优选含有0.43M氯化钠(2.5％w/v)或具有等价离子强度。 

在另一个优选的实施方案中，洗脱所述富含血管生成素的级分的流动相pH范围在4.0-9.0之间，优选5.5-7.5，并且最优选6.5。 

所述阳离子交换树脂可包括琼脂糖微球。优选地，所述琼脂糖微球的大小范围为45-900μm，并且更优选90-300μm。 

在一个实施方案中，在所述第一方面的方法的步骤(a)的过程中，所述阳离子交换树脂以约6-90升/升树脂/小时、优选以约6-50升/升树脂/小时并且最优选以约33升/升树脂/小时的流速处理。 

本发明第一方面所述的方法可以为连续法或分批法。优选地，所述方法为连续法。 

在一个实施方案中，所述富含血管生成素的级分的血管生成素含量为至少2％w/w，优选至少10％w/w，更优选至少20％w/w。