[发明专利]使用固氮弓菌苯基乙醇脱氢酶制备(4S)-3，4-二羟基-2，6，6-三甲基-环己-2-烯酮及其衍生物的方法

权利要求书

1.制备式(I)的旋光(4S)-4-羟基-2，6，6-三甲基环己-2-烯-1-酮衍生物的 方法：

其中R¹为氢、C₁-C₁₀烷基、C₇-C₁₄芳基烷基、碱金属M¹或碱土金属片 段M²_1/2或(M²)⁺X^-，其中M¹为Li、Na、K、Rb或Cs，且M²为Mg、Ca、Sr 或Ba，且X^-为单价阴离子；

所述方法包含以下反应步骤，其中在还原等效物的存在下，将选自氧 化还原酶类的酶(E)孵育于包含式(II)的三甲基环己-2-烯-1，4-二酮衍生物的 培养基中：

其中R²与R¹相同或不同，且为氢、C₁-C₁₀烷基、C₇-C₁₄芳基烷基、碱 金属M¹或碱土金属片段M²_1/2或(M²)⁺X^-，其中M¹为Li、Na、K、Rb或Cs， 且M²为Mg、Ca、Sr或Ba，且X^-为单价阴离子；

其中所述式(II)化合物经酶促还原为所述式(I)化合物，且所述反应过程 中消耗的还原等效物又通过所述酶(E)或另一种酶(E²)，使还原剂(RM)转化 为相应氧化产物(OP)而再生，且任选将至少部分所述氧化产物(OP)从该反 应培养基或反应平衡中移除，且分离所形成的所述产物(I)。

2.权利要求1的方法，其中所述酶(E)为醇脱氢酶。

3.权利要求2的方法，其中所述醇脱氢酶以NADH或NADPH作为还原 等效物，将所述式(II)化合物还原为所述式(I)化合物。

4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述酶(E)具有以下多肽序列：

(i)SEQ ID NO：2；或

(ii)与SEQ ID NO：2相比，其中多达25％的氨基酸残基通过缺失、插 入、取代或其结合改变，且保持了SEQ ID NO：2的至少50％酶活性的序列。

5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述酶(E)是选自来自固氮弓 菌属的微生物的酶，尤其是来自固氮弓菌属物种细菌EbN1的酶。

6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶由SEQ ID NO：1所示的 核酸序列或其功能等效物编码。

7.前述权利要求中任一项的方法，其中将包含至少一个伯醇或叔醇官 能团CH(OH)的有机化合物用作还原剂(RM)，尤其是异丙醇或葡萄糖用作 还原剂(RM)。

8.前述权利要求中任一项的方法，其中所述式(II)化合物的转化是在 选自以下科细菌的微生物存在下进行：肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、 乳酸杆菌科、链霉菌科、红球菌科、红环菌科及诺卡氏菌科。

9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物为核酸构建体转化 的重组微生物，所述核酸构建体编码权利要求1至4中任一项所定义的酶。

10.前述权利要求中任一项的方法，其中式(I)中的R¹为氢、甲基或钠， 尤其为氢或钠。

11.制备(3S，3′S)-虾青素的方法，其包含前述权利要求中任一项的方法 作为(3s，3′S)-虾青素的总合成中的一个反应步骤。