[发明专利]使用食肉植物产生重组蛋白的方法

说明书

本发明涉及产生至少一种蛋白质的方法，包括栽培食肉或食虫的植物， 其特征在于所述植物经过遗传修饰以表达所述一种或多种蛋白质。

今天，蛋白质代表一类广泛用于治疗或诊断领域并且用作实验室试剂的 分子。因此，对于改进现有的重组蛋白产生方法或开发新的更有效的产生系 统做出了许多努力。

用于产生重组蛋白的常规系统包括能够进行遗传修饰的不同类型的活 体：微生物(细菌、酵母、真菌)，培养的哺乳动物细胞，培养的昆虫细胞， 转基因动物或转基因植物。

转基因植物系统展现出优势。具体而言，它们提供更好的生物安全性， 因为没有已知的致病剂能够同时感染植物和动物。此外，通过栽培这些转基 因植物可以进行大规模生产。与其它工业生产系统相比也可以更廉价。使用 转基因植物还允许即将产生的蛋白质经历一种或多种翻译后的成熟过程。最 后，使用目前的植物生物技术，可以特异性地定向将在其中积累感兴趣蛋白 质的组织，例如叶或种子，这些组织是易于获得的。

重组蛋白的表达通常定向于叶或种子。叶为合成提供多种可能性(1)。因 此，例如，将经遗传修饰的烟草用于产生人血红蛋白。然而，有时叶含有难 以去除的不想要的物质(烟草叶中存在的多酚)。此外，重组蛋白必需迅速地 从这些叶中提取，因为它们快速地变质。

有时也使用种子作为贮藏组织，因为蛋白质在其中积累的环境具有低含 水量，稳定性更好。因此，例如，将经遗传修饰的玉米用于产生胃脂肪酶。 种子具有的局限性主要是由于合成能力较低，以及必需等到开花，从而增加 了因交叉授粉而扩散转基因的风险。

在这两种情况下，这些在转基因植物的叶或种子中产生重组蛋白的系统 的主要缺点与这样一个事实有关，即无论叶或种子，都需要要求苛刻的提取 /纯化阶段从植物组织分离重组蛋白。事实上，将重组蛋白插入植物组织基质， 这使得提取和纯化变得困难，同时这个步骤必需尽快进行，原因是在均化之 后的迅速蛋白质水解(2)。因此这最后一步限制了现有系统使用转基因植物产 生重组蛋白的优势。所以对于保留了目前使用转基因植物的产生系统的优势 而尽可能减少了它们的缺陷(尤其是通过大大简化重组蛋白的提取/纯化)的 系统存在实际需求。

食肉植物是能够捕捉猎物并且同化猎物的全部或部分来获得它们的一 部分氮需求的植物。除了它们从空气中固定二氧化碳用于它们的光合作用以 及经由它们的根吸收水和无机盐的能力之外，这些通常生活在缺乏营养的环 境中的植物在它们的叶上发育出不同类型的诱捕器(trap)，以多种方式发挥功 能来捕捉为它们提供额外的氮的猎物。尽管它们的形式和发挥功能的方式不 同，食肉植物的诱捕器具有共同的特性，即产生含有消化酶的液体，所述消 化酶或多或少允许了对猎物的有效消化和同化。

在食肉植物中存在表达并转运消化酶至诱捕器中的系统，在所述诱捕器 中这些存在于多少有些粘稠的液体中的酶可直接获得且易于纯化。此外，从 诱捕器中收集消化液可以在不破坏植物的条件下进行，因此植物能够继续生 产。在特定的属中，并且采取特定的措施，即使植物栽培在非无菌环境中， 消化液的收集可以在无菌条件下进行。最后，诱捕器中消化液的分泌可以由 因捕获昆虫的存在而产生的化学刺激甚或机械刺激来诱导。化学刺激可以通 过应用含有有机氮、磷酸盐、氯化钠、明胶、水杨酸或壳多糖的溶液来代替 (3；4)，由此潜在地简单增加纯化蛋白自消化液的产生。

因此多篇文献描述了食肉植物蛋白的纯化。申请EPO019808(5)描述在 癌症的治疗中使用食肉植物的消化液。按照相同的方式，申请WO9942115(6) 描述使用食肉植物的消化液来抑制特定疾病中涉及的激酶蛋白。专利申请 WO02057408(7)描述使用猪笼草属(Nepenthes genus)食肉植物叶汁中以天然 状态存在的壳多糖酶蛋白用于药物用途(抗真菌)或农业用途(抗隐花植物 病)。然而，在这些文献的每一篇中，产生和纯化的蛋白质均为食肉植物的 天然内源蛋白。因为所述食肉植物未经遗传修饰，所以不产生重组蛋白。这 些专利均未述及从食肉植物产生除那些天然条件下已经存在于这些植物中 的蛋白质之外的蛋白质。

另外，Hirsikorpi等的文章描述通过具有萤光素酶的载体农杆菌属 (Agrobacterium)转化圆叶茅膏菜(Drosera rotundifolia)(8)。然而，绝无任何结 果显示萤光素酶蛋白存在于所述植物叶表存在的汁液中。