[发明专利]结合分子

权利要求书

1.生产仅重链抗体的方法，包括：

用抗原攻击含重链基因座的非人类哺乳动物，该重链基因座：

包含多个V基因片段，其编码一个或多个(i)位于VL界面以降 低疏水性和(ii)位于其它位置以克服结构不稳定性的氨基酸突变；

包含至少一个D基因片段和至少一个J基因片段；

缺失编码CH1功能区的基因片段或已被工程化以阻止功能性 CH1功能区表达；和

在应答抗原攻击时表达，产生缺失CH1且具有由VH基因编码 的可溶性V_H区的仅重链抗体，其中该VH基因包含由于VDJ重排和 亲和力成熟而被掺入所述VH基因的优选V基因片段。

2.权利要求1的方法，其中，所述优选V基因片段和可选的优 选D和J片段通过亲和力成熟被进一步修饰，导致所产生的被引入 仅重链抗体的V_H区的稳定性和溶解性增强。

3.权利要求1或2的方法，其中，所述非人类哺乳动物通过以 下步骤产生：

体外产生包含所述基因座的转基因；和

将所述转基因引入到用于产生所述非人类哺乳动物的合适细 胞。

4.权利要求3的方法，其中，所述细胞是胚胎干细胞或卵母细 胞。

5.权利要求1或2的方法，其中，所述非人类哺乳动物通过同 源重组产生，其中，所述多个突变型V基因片段和可选的所述D和 J基因片段取代内源性重链基因座中的等同基因片段，所述重链基因 座在非人类哺乳动物中缺失CH1功能。

6.权利要求1至5的任一方法，其中，所述非人类哺乳动物包 含多个重链基因座，其中至少一个如权利要求1所限定，每个重链 基因座位于不同染色体上。

7.权利要求6的方法，其中，一个或多个基因座包含天然V基 因片段，而其余的基因座包含一个或多个工程化V基因片段。

8.权利要求6或7的方法，其中，位于每条染色体上的基因座 是不同的。

9.权利要求6的方法，其中，位于每条染色体上的基因座是相 同的。

10.权利要求1至9的任一方法，其中，V基因片段是突变型人 V基因片段。

11.权利要求1至10的任一方法，其中，所述基因座包含多个 D基因片段。

12.权利要求1至11的任一方法，其中，所述基因座包含多个J 基因片段。

13.权利要求1至12的任一方法，其中，所述基因座包含至少 一个编码恒定区的基因片段。

14.权利要求13的方法，其中，所述基因座包含多个编码恒定 区的基因片段。

15.权利要求13或14的方法，其中，编码恒定区的基因片段是 人的。

16.权利要求1至15的任一方法，其中，每一D基因片段和J 基因片段是人的。

17.权利要求1至16的任一方法，其中，每一V基因片段都编 码在位置37、44、45和47中一处或多处有突变的蛋白质。

18.权利要求17的方法，其中，每一V基因片段都编码在位置 37、44、45和47的全部位置都有突变的蛋白质。

19.权利要求17或18的方法，其中，V基因片段编码蛋白质， 在所述蛋白质中，位置37的残基是苯丙氨酸，位置44的残基是谷 氨酸，位置45的残基是谷氨酰胺，和/或位置47的残基是甘氨酸。

20.权利要求1至19的任一方法，其中，每一V基因片段都编 码在位置5和47中任一处有突变的蛋白质。

21.权利要求20的方法，其中，每一V基因片段都编码在位置 5和47都有突变的蛋白质。