[发明专利]对多核苷酸模板进行测序的方法

权利要求书

1.用于对靶标双链多核苷酸的第一和第二区域进行成对测序的方法，其中所述第一和第二区域在同一靶标双链多核苷酸上，该方法包括： 

(a)提供固体支持物，其上已固定有多个双链模板多核苷酸，其中每个都是由以5’端连接在所述固体支持物上的互补的第一和第二模板链所形成的；并提供能够与第一模板链的3’端杂交的一种或多种5’端固定的引物的多个拷贝； 

(b)选择性去除所述多个双链模板多核苷酸中的第二模板链，以允许第一模板链与5’端固定的引物杂交； 

(c)通过合成测序技术或通过基于连接的测序方法进行第一测序读取，以测定该模板多核苷酸中第一区域的序列； 

(d)进行延伸反应以延伸一个或多个所述固定的引物，从而复制第一模板链，以产生固定的第二模板链； 

(e)选择性去除所述多个双链模板多核苷酸中的第一模板链，以允许测序引物与(d)中产生的第二模板链杂交； 

(f)通过合成测序技术或通过基于连接的测序方法进行第二测序读取，以测定该模板多核苷酸中第二区域的序列，其中对所述靶多核苷酸中第一和第二区域的序列测定实现了对该靶双链多核苷酸中所述第一和第二区域的成对测序。 

2.根据权利要求1的方法，其中使用经标记的核苷酸或寡核苷酸进行所述测序读取。 

3.根据权利要求1的方法，其中所述模板被固定在单个平坦的固体支持物上或多个微球体上。 

4.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤 (b)或(e)中的选择性去除包括用内切核酸酶在被固定的双链模板多核苷酸中产生切口。 

5.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中步骤(b)或(e)中的选择性去除包括在被固定的双链模板多核苷酸中形成和切割无碱 基位点。 

6.根据权利要求5的方法，其中所述无碱基位点由尿嘧啶碱基产生或由8-氧代-鸟嘌呤碱基产生。 

7.根据权利要求6的方法，其中通过用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂合酶内切核酸酶VIII处理来去除所述尿嘧啶碱基。 

8.根据权利要求1的方法，其在步骤(c)前还包括使被固定的模板成为单链的额外步骤。 

9.根据权利要求1至3中任一项的方法，其中所述第一模板链通过二醇键进行附着，通过用包括高碘酸盐在内的化学切割剂进行处理来切割所述二醇键，随后使双链体变性。 

10.根据权利要求1的方法，其中通过延伸和变性的多个循环来重复步骤(d)。 

11.根据权利要求1的方法，其中至少一个被固定的引物在3’端被封闭，并在步骤(d)之前去除所述封闭。 

12.权利要求11的方法，其中所述封闭是磷酸基，并用磷酸酶处理所述表面以去除该封闭。 

13.根据权利要求1的方法，其中所述靶双链多核苷酸包含特定的核苷酸序列标签，以表明该多核苷酸的来源。