[发明专利]切割来自HPRT基因的DNA靶序列的大范围核酸酶变体及其用途

权利要求书

1.I-CreI变体，其为由第一和第二I-CreI单体组成的异二聚体，其 中所述两个I-CreI单体中至少一个单体在LAGLIDADG核心结构域的 位于I-CreI氨基酸序列SEQ ID NO：143或144中26到40位的第一功 能性亚结构域第26、28、30、32、33、38和/或40位中具有至少一个第 一替换，以及在LAGLIDADG核心结构域的位于所述I-CreI氨基酸序 列44到77位的第二功能性亚结构域第44、68、70、75和/或77位中含 有至少一个第二替换，其中所述第一和第二I-CreI单体选自以下序列 对：SEQ ID NO：32与52，SEQ ID NO：32与53，SEQ ID NO：32与54， SEQ ID NO：32与55，SEQ ID NO：32与56，SEQ ID NO：32与57，SEQ  ID NO：32与58，SEQ ID NO：32与60，SEQ ID NO：32与65，SEQ ID  NO：32与66，SEQ ID NO：32与67，SEQ ID NO：32与68，SEQ ID NO： 32与69，SEQ ID NO：32与70，SEQ ID NO：32与71，SEQ ID NO：32 与72，SEQ ID NO：32与73，SEQ ID NO：32与74，SEQ ID NO：75与 56，SEQ ID NO：76与56，SEQ ID NO：77与56，SEQ ID NO：78与56， SEQ ID NO：79与56，SEQ ID NO：80与56，SEQ ID NO：81与56，SEQ  ID NO：82与56，SEQ ID NO：147与148，并且

其中所述I-CreI变体能够切割来自HPRT基因的序列SEQ ID NO： 4的DNA靶序列。

2.I-CreI变体，其为根据权利要求1的异二聚体的变体，其中所述 异二聚体的单体之一还包含G19S突变，该突变提高I-CreI变体对来自 HPRT基因之SEQ ID NO：4的DNA靶序列的切割活性。

3.单链大范围核酸酶，其包含由肽间隔区连接的根据权利要求1 或2的I-CreI变体的两个单体。

4.表达载体，其包含至少一个多核苷酸片段，所述多核苷酸片段 编码权利要求1或2的I-CreI变体或者根据权利要求3的单链大范围核 酸酶。

5.根据权利要求4的表达载体，其包含靶向DNA构建体，所述靶 向DNA构建体包含待引入序列，所述待引入序列的侧翼是与SEQ ID  NO：4DNA靶标周围的HPRT基因区共有同源性的序列。

6.原核细胞、酵母细胞或动物细胞，其被以下修饰：(i)编码根据 权利要求1或2的I-CreI变体或根据权利要求3的单链大范围核酸酶的 多核苷酸片段，或(ii)根据权利要求4或5的表达载体。

7.组合物，其包含至少一种根据权利要求1或2所定义的I-CreI 变体或根据权利要求3的单链大范围核酸酶，和/或至少一种根据权利 要求4或5的表达载体。

8.根据权利要求1或2的I-CreI变体、根据权利要求3的单链大 范围核酸酶和根据权利要求4或5的表达载体用于在仓鼠(Criteculus  sp.)HPRT基因中诱导位点特异性修饰的非治疗目的的用途。

9.根据权利要求1或2的I-CreI变体、根据权利要求3的单链大 范围核酸酶或者根据权利要求4或5的表达载体和包含靶向DNA构建 体的载体用于在仓鼠(Criteculus sp.)HPRT基因中诱导位点特异性修 饰的非治疗目的的用途，所述靶向DNA构建体包含待引入序列，所述 待引入序列的侧翼是与SEQ ID NO：4DNA靶标周围的HPRT基因区 共有同源性的序列。

10.根据权利要求8或9的用途，其中HPRT基因的所述位点特异 性修饰是通过以所述I-CreI变体或单链大范围核酸酶切割HPRT基因 并与包含侧翼是与所述I-CreI变体或单链大范围核酸酶之基因组DNA 切割位点周围的HPRT基因区域共有同源性之序列的目的基因的靶向 DNA构建体进行同源重组而插入目的基因。