[发明专利]萤光素酶信号增强组合物

说明书

发明领域

本发明一般涉及在萤光素酶催化的反应中、例如在基于萤光素酶的报 告基因测定和其中使用萤光素酶作为与分子(例如用于免疫细胞化学测定 或酶联免疫吸附测定(ELISA)的抗体)结合的可检测和/或可量化标记的 应用中使用的试剂和组合物。本发明也提供了尤其用于提高萤光素酶催化 反应的灵敏度和/或改进萤光素酶催化反应的动力学的方法和组合物。

发明背景

报告基因测定代表基因表达研究中一种重要的工具，允许理解控制感 兴趣基因表达的因素，例如DNA序列、转录因子、RNA序列、RNA-结合 蛋白、信号转导途径和特定的刺激。尤其是，报告基因测定可用来鉴定在 基因调节中重要的核酸区域。这样的区域和/或结合或调控它们的因子可以 在治疗或预防人类疾病中作为治疗性干预的潜在靶。报告基因测定也可用 来根据药物修饰基因表达的能力而筛选药物。

报告基因测定一般被用来鉴定基因启动子区域或启动子内的特定元 件，如转录因子结合位点或其他调节元件。可选地，该测定被用来研究启 动子或调节元件对各种刺激或物质的响应。在一些应用中，测定中使用的 报告基因构建体或转染细胞被引入生物体以在体内研究启动子的功能。进 一步，报告基因测定可被用来研究或测定特定启动子上游的信号转导途 径。

作为实例，在设计为研究推定的启动子序列或其他转录调节元件的报 告基因测定中，待询问的核酸被克隆进报告质粒内的某一位置以允许调节 下游报告基因转录并因此调节由报告基因编码的报告蛋白表达。为便于检 测，报告蛋白与存在于其中转染了报告质粒的细胞内的内源蛋白应该是可 区别的，并且优选地报告蛋白的表达应该是容易量化的。在适当的测定中 报告蛋白被定量，并且常常表示为相对于由诸如例如启动子SV40的普遍 存在的启动子驱动的对照报告基因的水平。对照报告基因与测试报告基因 必须是可区别的，并且一般被包含在与测试载体共转染并用来控制转染率 的单独载体上。该测定基于细胞成比例地接纳等量的两种载体的前提。

报告基因测定的多种不同应用涉及测定基因表达随时间或在加入诸 如药物、配基、激素等化合物之后的改变。这在药物筛选中特别重要。加 入药物后，检测报告蛋白水平的可测定改变可被延迟和稀释，因为表达水 平的改变通过mRNA传递至蛋白质。近来由本申请人做出的此类应用的显 著进步是在报告载体中组合使用mRNA-和蛋白质-去稳定元件以改进响应 的速度和幅度，如同时待审的美国专利申请第10/658,093号所述，其公开 内容通过引用并入本文。

使用不同可检测报告蛋白的各种报告基因测定系统是可商业获得的， 最常见的可检测报告蛋白是氯霉素转移酶(CAT)、β半乳糖苷酶(β-gal)、 分泌型碱性磷酸酶和各种荧光蛋白和萤光素酶。

萤光素酶是用于体外测定系统的最常用的报告蛋白。萤光素酶是能生 物发光的酶，并且天然地存在于一些生物体中。在可商业获得的测定系统 中，萤光素酶可被分为使用D-萤光素作为底物的萤光素酶和使用腔肠素作 为底物的萤光素酶。最广泛采用的前者的实例是萤火虫萤光素酶(一种胞 内酶)。使用D-萤光素的萤光素酶的额外实例包括鞘翅目(Coleoptera)的 其他成员，如叩头虫和苹果蝇蛆。也可根据它们从其衍生的生物体是陆生 的还是水生的(一般海洋的)来区别萤光素酶。使用腔肠素作为底物的萤 光素酶一般衍生自海洋动物，如软珊瑚海肾(Renilla)或桡足类Gaussia， 而使用D-萤光素的萤光素酶一般衍生自陆生动物。区别萤光素酶的进一步 的方法是根据在其天然状态(即在它们从其衍生的生物体中)它们是分泌 型还是非分泌型。衍生自陆生生物的萤光素酶一般是非分泌型(胞内的)， 而衍生自海洋生物的萤光素酶可以是分泌型或非分泌型(胞内的)。例如 海肾萤光素酶是胞内的，而Gaussia萤光素酶在其天然状态是分泌型酶。 海洋生物分泌萤光素酶被认为是设计为分散接近的捕食者注意力的保护 性响应。其他分泌型萤光素酶包括来自Metridia longa、Vargula hilgendorfii、 细角刺虾(Oplophorus gracilirostris)、剑乳点水蚤(Pleuromamma xiphias)、 海萤夜光虫(Cypridina noctiluca)以及长腹水蚤科(Metridinidae)其他成 员的萤光素酶。喉萤(Vargula)萤光素酶使用不同于腔肠素或D-萤光素的 底物。另一类萤光素酶是衍生自沟鞭藻类(dinoflagellates)的萤光素酶。