[发明专利]用于蛋白质生产的最优化的宿主细胞

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年11月30日提交的美国临时申请号60/872,281 的优先权的权益。该申请的内容通过引用将其全部并入本文。

发明背景

[0001]选择生产高水平重组蛋白质的细胞系是生物技术中最大的 挑战之一。用于蛋白质生产的细胞宿主群体常常表现为遗传学上异质 的细胞，它们具有不同的生长属性及其他属性。甚至当这些宿主群体 是来源于一个个体细胞的群体时，对此细胞进行培养久而久之会导致 产生这样的细胞群体，其中个体细胞以一种或多种累积的遗传差异为 特征。为了生产蛋白质，将编码目的蛋白质的一种或多种遗传序列引 入细胞中。引入了遗传序列的群体中的每个细胞可以吸收不同拷贝数 的遗传序列，而这些序列中的任何一条又可以整合入此细胞基因组中 不同位置。结果产生了细胞的很大的多样性，其中每个细胞具有生产 目的蛋白质的不同潜力。为了生产蛋白质，有可能使用全部或部分引 入了遗传序列的宿主细胞，或者也有可能测试细胞的克隆群体、或由 这个群体中分离的单个细胞衍生而来的细胞系，以鉴别具有最佳蛋白 质生产及其他特征的细胞，其他特征如对蛋白质生产有利的某种生长 或增殖特征。由于细胞巨大的多样性，难以从有成千上万个细胞的群 体中鉴定并分离出具有增加的生产目的RNA(例如，编码目的蛋白的 一个RNA)能力的单个细胞。有限稀释是鉴定用于蛋白质生产的细胞 系的一种普通方法，其中将几百和如果通过机器人技术自动化则数千 个单个分离的细胞进行培养，以产生克隆群体，然后评估克隆群体的 蛋白质生产能力。然而，由于细胞在蛋白质生产和其他特征(如生长 或增殖速率)二者上的巨大多样性，测试如此相对小数目的细胞对于 鉴别最佳细胞系是一种低效(ineffective)的方法。流式细胞仪或细 胞分选具有分析及分离单个细胞的能力，能对更巨大数目的个体细胞 进行测试，是另一种有助于选择这种稀有细胞的方法。然而，流式细 胞技术中用到的很多测量个体细胞中RNA或蛋白质生产的标准方法常 常需要杀死正被测量的细胞，或者不能在单个细胞中测量蛋白质生产。 此外，这些现在应用的方法不能够评估细胞的增殖速率。因此，需要 有方法用于鉴定、分离及培养具有增加的RNA或蛋白质生产速率的细 胞的高通量方法，其中还根据最优化的生长及增殖属性选择细胞。

[0002]现有增加细胞中蛋白质生产的方法还聚焦在最优化培养基 配方上。例如，增加或减少生长培养基的多种成分如糖、盐、氨基酸、 维生素等。例如，参见Chu和Robinson，Curr Opin Biotechnol.2001 Apr；12(2)：180-7；Chun等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb； 19(1)：52-7；Dempsey等人，Biotechnol Prog 2003 Jan-Feb；19 (1)：175-8；及Sauer等人，Biotechnol Bioeng.2000 Mar 5； 67(5)：585-97。这些努力聚焦在异质细胞群体上。也有可能产生可 靠地生产高水平蛋白质的克隆细胞群体，并为此克隆群体最优化培养 基。

[0003]此外，表达高水平目的RNA的细胞可以将其很多能量花费 在蛋白质生产中并且因此生长速率降低(Gu等人，Cytotechnology. 1992：9(1-3)：237-45和Kromenaker等人，Biotechnol Prog.1994 May-Jun；10(3)：299-307)。具体而言，当使用非克隆细胞群体时， 生长速率降低会导致蛋白质生产降低的细胞过度生长。选择在不同或 最优化的培养基条件下具有最佳生长谱和增殖谱的细胞的方法还有助 于建立用于最优化的生产蛋白质的细胞群体。

发明概述

[0004]本发明涉及分离表达增加水平的目的RNA或蛋白质的细胞 的方法。本发明还涉及分离具有改变的细胞增殖速率的细胞，例如具 有增加或降低的细胞增殖速率的细胞的方法。还提供了分离具有改变 的细胞增殖速率(例如，增加或降低的细胞增殖速率)的细胞的方法， 其中所述细胞还表达增加水平的目的RNA或蛋白质。