[发明专利]具有增强的动力学和功能性表达的突变水解酶蛋白

权利要求书

1.第一突变脱卤素酶，其相对于第二突变脱卤素酶包括至少一个氨基 酸取代，其中所述第一和第二突变脱卤素酶与包括一个或多个官能团的脱 卤素酶底物形成键，所述键比在相应的野生型脱卤素酶和所述底物之间形 成的键更稳定，其中在所述第一突变脱卤素酶中而不在所述第二突变脱卤 素酶中的至少一个氨基酸取代是提高功能性表达或结合动力学的取代，其 中所述第一和第二突变脱卤素酶具有在这样的残基处或在这样的氨基酸 残基处的至少一个氨基酸取代，所述残基在所述相应的野生型脱卤素酶中 与活化水分子有关，所述活化水分子裂解所述相应的野生型脱卤素酶和所 述底物之间形成的键，所述氨基酸残基在所述野生型脱卤素酶中与底物形 成酯中间体，并且其中提高功能性表达或结合动力学的所述至少一个取代 位于与SEQ ID NO：1中位置5，11，20，30，32，47，58，60，65，78，80，87，88， 94，109，113，117，118，124，128，134，136，150，151，155，157，160，167，172， 187，195，204，221，224，227，231，250，256，257，263，264，277，282，291或 292相对应的位置处。

2.权利要求1的第一突变脱卤素酶，其具有位于与SEQ ID NO：1中位 置5，11，20，30，32，58，60，65，78，8087，94，109，113，117，118，124，134， 136，150，151，155，157，172，187，204，221，224，227，231，250，256，263，277， 282，291和292相对应的位置处的至少2个取代。

3.权利要求1或2的第一突变脱卤素酶，其具有位于与SEQ ID NO：1 中位置58，78，87，155，172，224，227，291，292相对应的位置处或其多处的 取代，和位于与SEQ ID NO：1中位置175，176，272或273相对应的位置处 或其多处的取代。

4.权利要求1或2的第一突变脱卤素酶，其具有位于与SEQ ID NO：1 中位置58，78，155，172，224，291，或292相对应的位置处或其多处的取代， 和位于与SEQ ID NO：1中位置175，176，272或273相对应的位置处或其多 处的取代。

5.权利要求1-4中任一项的第一突变脱卤素酶，其中位于与位置291 相对应的位置处的取代的氨基酸是G、S或Q。

6.权利要求1-5中任一项的第一突变脱卤素酶，其具有位于与位置272 相对应的残基处的取代，并还包括位于与SEQ ID NO：1中位置175，176或 273相对应的位置处的一个或多个取代。

7.权利要求1-6中任一项的第一突变脱卤素酶，其还包括目的蛋白， 由此产生融合蛋白。

8.权利要求7的第一突变脱卤素酶，其中所述目的蛋白是选择标记蛋 白、膜蛋白、胞质蛋白、核内蛋白、结构蛋白、酶、酶底物、受体蛋白、 转运蛋白、转录因子、通道蛋白、磷蛋白、激酶、信号传导蛋白、代谢蛋 白、线粒体蛋白、受体相关蛋白、核酸结合蛋白、胞外基质蛋白、分泌蛋 白、受体配体、血清蛋白、免疫原性蛋白、荧光蛋白、或具有反应性半胱 氨酸的蛋白。

9.权利要求1-8中任一项的第一突变脱卤素酶，其中所述第一和第二 突变脱卤素酶中的所述至少一个取代位于与紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)脱卤素酶的氨基酸残基272相对应的位置处。

10.权利要求9的第一突变脱卤素酶，其中位于与氨基酸残基272相 对应的位置处的取代的氨基酸是天冬酰胺、谷氨酰胺、苯丙氨酸、甘氨酸 或丙氨酸。

11.权利要求1-10中任一项的第一突变脱卤素酶，其中位于与位置80 相对应的位置处的取代的氨基酸是Q、N、K或T。

12.权利要求1-11中任一项的第一突变脱卤素酶，其中所述第一和第 二突变脱卤素酶还包括位于位置273处的取代。