[发明专利]HIV NC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种HIV NC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。更具体而言，本发明涉及其中分别在NC基因的上游和下游依次连接有内含子序列和mRNA稳定性元件的HIV NC蛋白表达载体以及用其生产NC蛋白的方法。

背景技术

HIV(人免疫缺陷症病毒)的核壳蛋白(下文称为‘NC’)不仅在病毒组装中起到结构性作用，且在病毒生命周期中也起着功能性作用，其作用如下文所述。首先，NC蛋白参与病毒的基因组包装，这种功能是归功于由特征性Cys-X2-Cys-X4-His-X4-Cys基序(CCHC基序)组成的两个锌指结构域。已知所述结构域在所有的逆转录病毒中均表现高保守性，并且在HIV RNA包装和感染性病毒的生产中是必需的。其次，已经知道NC蛋白在病毒的逆转录(reverse transcription，RT)过程中会促进tRNA引物的退火和链转移，由此可见NC蛋白在病毒复制中发挥重要的功能。第三，NC蛋白具有病毒生命周期中所必需的核酸伴侣蛋白的活性。另外，最近还有报道称在病毒DNA插入宿主染色体中时NC蛋白也起到特定作用。因此，可以说对NC蛋白的研究对于阐明NC蛋白在HIV生命周期中的生物功能以及开发对核心的HIV蛋白有效的抗病毒制剂有着重要的意义。

了解NC蛋白的体内生物学功能的必需前提条件是开发出在动物细胞中表达NC蛋白的有效方法。但是因病毒的密码子使用与动物细胞的密码子使用不同，或者由于所述病毒基因中的一些内包含抑制序列(INS)，从而使HIV的其他结构蛋白在动物细胞中的表达受限。问题是即便NC蛋白与HIV的其他结构蛋白不同，不包含INS，它也很难在动物细胞中表达。因此，大部分对NC蛋白的研究都是通过利用在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组NC蛋白或通过利用基因分析来进行的。

同时，也有一些实例是通过将稀有密码子替换为宿主的优选密码子(密码子优化)来增强异源表达水平。例如，已有报道指出将BPV(牛乳头状瘤病毒)的晚期基因L1和L2针对哺乳动物的密码子使用模式(Codon Usage Pattern)进行密码子优化，导致与野生型HPV的那些序列的表达水平相比水平，它们在哺乳动物细胞(Cos-1)培养物中的表达水平增加(Zhou et.al.J.Virol 73，4972-4982，1999)。在上述研究中，将与在哺乳动物中相比在BPV中的出现频率超过2倍的每个BPV密码子(使用率＞2)以及使用率超过1.5的大部分密码子保守性地替换为优先使用的哺乳动物密码子。在WO97/3115号、WO97/48370号及WO98/34640号PCT申请(Merck & Co.，Inc.)中，已经证明通过对HIV基因或者其片段的密码子优化增加了蛋白质表达，并且当将所述密码子优化序列在宿主哺乳动物中用作DNA疫苗时提高了免疫性，针对所述宿主哺乳动物对该优化进行了调整。

本发明的发明人已经着眼于这些问题，并且努力开发一种用于生产能够解决这些问题的HIV NC蛋白的方法。但是已经发现仅通过密码子优化尚不能表达野生型NC蛋白，而通过分别在NC基因的上游和下游额外连接内含子序列和mRNA稳定性元件和使用这种RNA优化可表达出野生型的NC蛋白，并可显著提高其表达效率，从而完成了本发明。

发明内容

技术问题

鉴于上述问题，本发明旨在于提供一种其中额外连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIV NC蛋白表达载体以及一种用其生产NC蛋白的方法。

技术方案

为了达到上述目的，本发明提供一种其中额外连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIV NC蛋白表达载体。

此外，本发明提供用所述载体转化的转化体。

此外，本发明提供利用所述载体生产HIV NC蛋白的方法。

有益效果

本发明的其中依次连接有内含子序列以及位于NC基因下游的mRNA稳定性元件的HIV NC蛋白表达载体，可在动物细胞中表达野生型NC蛋白，并且与现有技术相比具有提高表达效率的作用。

附图说明

参照附图所举例说明的某些示例性实施方案详细地描述本发明的上述及其他特征，所述附图在下文中仅通过举例说明的方式给出，并且因此不是对本发明的限制，其中：

图1是示出了对HIV NC多核苷酸密码子优化前后的各密码子偏好的图；

图2是示出了本发明的HIV NC蛋白表达载体pCMV(-HA)NC/RRE的制造过程的示意图；