[发明专利]以切割反应检测核酸的方法和组合物

权利要求书

1.一种检测靶核酸的方法，其包括：

(a)提供：

靶核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，

模板核酸，其从3′到5′方向包含第一区域和第二区域，

与所述靶核酸的所述第一区域至少部分互补的第一寡核苷酸，

包含5′区域和3′区域的第二寡核苷酸，其中所述3′区域与所述靶核酸的所述第二区域互补，且其中所述5′区域不与所述靶核酸互补，但与所述模板核酸的所述第一区域至少部分互补，

包含5′区域和3′区域的第三寡核苷酸，其中所述3′区域与所述模板核酸的所述第二区域至少部分互补，且所述5′区域不与所述模板核酸互补，

切割剂，以及

聚合剂；

(b)在反应条件下混合所述靶核酸、所述模板核酸、所述第一寡核苷酸、所述第二寡核苷酸、所述第三寡核苷酸、所述切割剂和所述聚合剂，其中所述反应条件允许：

所述靶核酸与所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸中的每一个形成双链体，其中所述第二寡核苷酸的5′区域形成第一切割结构的第一活瓣，

以所述切割剂切割所述第一活瓣，从而允许释放第一活瓣，

以所述释放的第一活瓣、所述模板核酸和所述第三寡核苷酸形成第二双链体，其中所述第三寡核苷酸的5’区域形成第二切割结构的第二活瓣，以及

以所述切割剂切割所述第二活瓣；以及

(c)检测所述第二活瓣切割所产生的信号，其中仅当形成所述第一双链体时所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸至少被切口分开时，方产生所述信号。

2.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸具有与所述靶核酸不互补的单个3′核苷酸。

3.权利要求1的方法，其中所述第二寡核苷酸和第三寡核苷酸是抗切割的寡核苷酸。

4.权利要求1的方法，其中所述释放的活瓣具有与所述模板核酸不互补的单个3′核苷酸。

5.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸具有与所述靶核酸不互补的两个或更多的3′核苷酸。

6.权利要求1的方法，其中所述第一寡核苷酸和/或释放的活瓣包含3′封闭。

7.权利要求1的方法，其中所述释放的活瓣具有与所述模板核酸不互补的两个或更多的3′核苷酸。

8.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被切口分开。

9.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。

10.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。

11.权利要求1的方法，其中形成所述第一双链体时，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开.

12.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被切口分开。

13.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被1个核苷酸长的缺口分开。

14.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被2个核苷酸长的缺口分开。

15.权利要求1的方法，其中形成所述第二双链体时，所述释放的活瓣和所述第三寡核苷酸被3个核苷酸长的缺口分开。

16.权利要求1的方法，其还包括正向引物。

17.权利要求16的方法，其中所述正向引物与所述靶核酸的第一区域互补。

18.权利要求16的方法，其还包括反向引物。

19.权利要求1的方法，其中所述聚合剂缺乏5′到3′外切核酸酶活性。

20.权利要求1的方法，其中所述聚合剂是热稳定的。

21.权利要求1的方法，其中单个酶包含所述聚合剂和所述切割剂。

22.权利要求22的方法，其中所述酶是大肠杆菌DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶。