[发明专利]酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种酶催化的高度支化的直链淀粉和支链淀粉簇的制备方法，具体地，本发明涉及的方法包括以下步骤：用分支酶或α-葡聚糖转移酶水解支链淀粉以产生支链淀粉簇，同时，用分支酶处理直链淀粉以制备支化的直链淀粉，该支化的直链淀粉中糖苷的侧链是支化的；以及利用麦芽糖淀粉酶的转糖基活性，由已制备的支链淀粉簇和支化的直链淀粉制备得到高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉和支化的寡糖。

背景技术

高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉是新的功能性材料，它们是高度水溶性的，并能延缓在小肠内的消化，防止血液葡萄糖水平急剧升高，而且能通过持续的能量供应来增强运动力，因此需要一种能够有效制备此种新的功能性材料的方法。

α-葡聚糖转移酶或分支酶能水解支链淀粉簇之间的片段，从而产生支链淀粉簇。此外，当分支酶与直链淀粉反应时能产生支化的直链淀粉。麦芽糖淀粉酶水解淀粉后主要产生麦芽糖单位，并且该酶还通过形成多种糖苷键而展示出高度的转糖基活性，所述糖苷键的形成可以产生高度支化的支链淀粉和直链淀粉，其中葡萄糖通过α-1，6糖苷键而连接在非还原末端。

发明内容

因此，本发明的目的是利用麦芽糖淀粉酶、以及α-葡聚糖转移酶或分支酶提供一种作为新的功能性材料的高度支化的支链淀粉和直链淀粉。

为了实现上述目的，以从枯草杆菌(Bacillus subtilis)168中分离的分支酶或从水生栖热菌(Thermus scotoductus)中分离的α-葡聚糖转移酶在pH5.5-7.5和30-75℃条件下对支链淀粉和直链淀粉进行处理，随后再用从嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)中分离的麦芽糖淀粉酶在45-65℃下进行处理，结果产生高度支化的支链淀粉簇和直链淀粉。

本发明的特征在于提供了通过将淀粉与分支酶或α-葡聚糖转移酶、以及麦芽糖淀粉酶进行反应，来制备高度支化的支链淀粉簇、高度支化的直链淀粉和支化的寡糖的方法。

所述淀粉可以选自淀粉、含淀粉的谷物、或支链淀粉和直链淀粉。

本发明方法的特征在于包括以下步骤：向淀粉中加入从枯草杆菌(Bacillus subtilis)168中分离的分支酶或从水生栖热菌(Thermusscotoductus)中分离的α-葡聚糖转移酶，在30-75℃下孵育30分钟到4小时，从而产生支链淀粉簇或支化的直链淀粉；将上述得到的支链淀粉簇或支化的直链淀粉，用来源于嗜热脂肪杆菌(Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶在45-65℃下处理2-4小时。

所述α-葡聚糖转移酶、分支酶和麦芽糖淀粉酶可以是从天然的原核或真核生物体分离和纯化的典型的酶，或者可以是通过人工表达的方法用重组DNA技术产生的所述酶的基因而制备的。

根据本发明，所述α-葡聚糖转移酶通过下述方法制得：将编码来自水生栖热菌(Thermus scotoductus)的α-葡聚糖转移酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌(Bacillus subtilis)ISW 1214中，然后将表达的酶纯化。所述分支酶通过下述方法制得：将编码来自枯草杆菌(Bacillus subtilis)168的分支酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌中，然后将表达的酶纯化。所述麦芽糖淀粉酶也通过以下的方法制得：将编码来自嗜热脂肪杆菌(Bacillusstearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶的基因克隆，并转化到枯草杆菌LK87中，然后将表达的酶纯化。

在上述酶中，分支酶可以从枯草杆菌168中分离得到或利用基因工程方法制备得到。根据本发明的一个实施例，所述分支酶通过如下步骤产生：

(a)插入从枯草杆菌168中分离的编码分支酶的DNA序列，从而制备得到重组载体；(b)将重组载体引入宿主细胞，从而制备得到转化体；以及(c)培养所述转化体以产生淀粉酶。

在步骤(a)中，可以将编码分支酶的序列插入到典型的表达载体(即pET-22b(+))中，但是最好根据宿主细胞来选择合适的载体。在本发明的一个实施例中，制备了具有如图2所示的剪切图谱的p6xHTKNd载体。

在转化的步骤(b)中，所述宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞或衍生自真核细胞的细胞，包括大肠杆菌、乳酸细菌、酵母、真菌等等，但并不限于此。转化的方法可以利用众所周知的常用方法进行。