[发明专利]使用固态pH传感器的qPCR

说明书

技术领域

本发明涉及一种通过使用pH敏感性的离子敏感场效应晶体管(ISFET) 来监测扩增过程中的引物延伸阶段的质子释放，从而对核酸扩增进行定量的 实时监测方法，例如，聚合酶链式反应(PCR)的扩增、连接酶链式反应或 转录介导的扩增。本发明还提供了用于此目的的包括pH敏感性的离子敏感 场效应晶体管(ISFET)的传感装置。

背景技术

定量实时聚合酶链式反应(qPCR或RT-PCR)已经成为实际上用于小量 DNA或RNA扩增的标准方法，例如，用于克隆基因序列、法医检测以及与 疾病有关的突变的遗传检测。qPCR的最具体的实施方式需要标记的探针(例 如，荧光染料)以监测扩增子。此处公开的qPCR取消了对标记的探针的需 要。替代地，本方法依赖于对PCR循环导致的质子释放具有感应的pH敏感 性的离子敏感场效应晶体管(ISFET)，并由此可以在芯片上进行。

如在公布的国际专利申请WO03/073088中所报道的，发明人先前发现 ISFETs可以用于监测与寡核苷酸链末端处的单个核苷酸插入有关的质子释 放。通过pH敏感性的ISFETs对单个核苷酸插入的监测可以用于基于常规桑 格(Sanger)DNA测序法的DNA测序并可以用于识别等位突变体，例如， 依赖于检测靶向特异性核酸位点而设计的寡核苷酸引物的延伸的单核苷酸 多态性(SNPs)。本发明得自于发明人进一步认识到质子也是PCR产物，因 此qPCR也可以通过监测质子释放的离子敏感场效应晶体管(ISFET)来实 现，优选在低反应体积的室内进行。

发明内容

因此，本发明的一方面提供了一种监测样品中核酸扩增的方法，所述样 品含有当样品中存在目标(target)序列的情况下用于扩增目标序列的核酸扩 增缓冲混合物，其特征在于，所述监测是检测在目标序列的存在下当扩增开 始超过所述样品的缓冲能力能够克服的循环数阈值时由于质子释放而产生 的pH值的变化，所述检测使用了传感装置，该传感装置包括具有传感表面 的离子敏感场效应晶体管(ISFET)和用于检测来自离子敏感场效应晶体管 (ISFET)的电子输出信号的设备，所述传感表面暴露于所述样品并且被配 置成能够响应在所述晶体管表面的pH值变化而产生电子输出信号。为了在 监测中获得需要的敏感度，优选在小体积(更优选纳米级体积)内以及在低 缓冲能力下进行扩增，从而使释放的质子的数目导致pH值的快速变化(当 超过样品的缓冲能力时)。因此，这种方法可以方便地在整合有设置在微流 体(microfluidic)设备或芯片内的pH敏感性的ISFET的纳米级反应器中实 施。

附图说明

通过举例的方式并结合以下附图对本发明的具体实施方式进行描述，其 中：

图1显示了使用缓冲的反应介质在DNA链延伸过程中发生的pH值变 化。

图2为先前用于DNA测序的场效应晶体管的示意图。

图3为先前用于DNA测序的成对的场效应晶体管的示意图。

图4显示了使用成对的场效应晶体管对DNA模板进行桑格(Sanger) 类型的DNA序列测定的结果示意图，在反应混合物中使用全部所需的 dNTPS和单个ddNTP。

图5图示地显示了导致目标核酸序列的扩增的PCR循环。

图6显示了在DNA序列测定中使用本发明物而监测到的通过DNA延 伸产生的质子释放。

图7显示了使用ISFET pH传感器的模拟实时定量PCR的结果。

图8为显示了在用于进行qPCR的小体积反应室内包括嵌入的ISFET的 微流体设备的示意图。

图9为另一种微流体设备的示意图，所述微流体设备用于对具有盖板20 的反应室/孔19内的固定样品进行PCR监测。通过加热元件21可以对芯片 进行加热，并且能够依次地被冷却至各种需要的温度以用于所述样品的热循 环。

图10显示了根据本发明的用于进行PCR监测的微流体设备的平面图和 截面图，其中，所述样品流经微流体通道22，例如，进入丙烯酸或甲基丙烯 酸甲酯平台，所述样品连续地穿过维持在分别用于DNA变性、引物杂交至 标靶上以及引物延伸的不同温度下的硅芯片基底23的区域。显示了用于样 品进行PCR的热循环的三个温度区域。