[发明专利]具有改善的表达和稳定性的DNA质粒

说明书

引入作为参考

本申请参考于2006年4月27日提交的美国临时申请60/795,324。本文引用或参考的所有文件(“本文引用文件”)，以及本文引用文件中引用或参考的所有文件，连同关于本文或引入本文作为参考的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品规格说明和产品清单，在此引入本文作为参考，并且可以在本发明的实践中使用。

发明领域

总的来说，本发明涉及DNA疫苗和使用其的方法。更具体而言，本发明涉及可用于DNA疫苗的具有改善的表达和稳定性的DNA质粒。

发明背景

DNA疫苗也称为基因、质粒或多核苷酸疫苗，代表利用基因转移用于针对抗原免疫接种的相对简单和经济的方法。与DNA疫苗相关的低毒性有利于它的进一步开发，但如果要将它成功地整合到临床环境内，那么需要改善这种方法的效力的另外策略(由Shaw和Strong，Front Biosci.2006 Jan 1；11：1189-98综述)。DNA疫苗接种可以克服常规疫苗策略的大多数缺点，并且具有用于未来疫苗的潜力。然而，商业产品仍未到达市场。一个可能的解释可以是该技术无法在人中诱导有效的免疫应答，但安全性也可能是基本问题(由Glenting和Wessels，Microb Cell Fact.2005 Sep 6；4：26综述)。

pVR1020或1012质粒(VICAL Inc.；Luke C.等人，Journal ofInfectious Diseases，1997，175，91-97；Hartikka J.等人，HumanGene Therapy，1996，7，1205-1217，参见例如，美国专利号5,846,946；6,451,769；6,586,409和6,875,748)是利用多核苷酸序列插入的DNA质粒载体。pVR1020质粒衍生自pVR1012，并且包含人tPA信号序列。另外的DNA质粒在例如美国专利号6,852,705；6,818,628；6,586,412；6,576,243；6,558,674；6,464,984；6,451,770；6,376,473和6,221,362中发现。然而，关于基于pVR1012的质粒用于DNA疫苗接种存在缺点，例如质粒不稳定性和拷贝数异质性。

因此，需要有效的DNA疫苗，特别是就目的靶抗原、表位、免疫原、肽或多肽以足以引发保护应答的量表达而言。

本申请中任何文件的引用或鉴定并非承认此种文件可用作本发明的现有技术。

发明概述

本发明部分基于下述实验观察：如预期的，在卡那霉素抗性基因启动子和翻译起始之间插入转座子取消卡那霉素抗性，并且出乎意料地，使得能够高速率的质粒复制。换言之，突变型(包含转座子)的质粒产率比亲本质粒产率高3倍。因此，假设卡那霉素抗性(“KanaR”)基因的表达效率对细菌中的质粒复制有影响，即减少的卡那霉素抗性表达导致增加的质粒复制率。特别地，高KanaR表达率可能代表强代谢负荷，这干扰最佳质粒复制率和/或KanaR基因转录干扰复制起点(ORI)。

本发明涉及可以包含卡那霉素抗性(“KanaR”)基因的DNA质粒，其中卡那霉素抗性基因包含对于KanaR表达较不有效的启动子和/或较不有效的起始密码子。在一个有利的实施方案中，KanaR启动子是P1启动子。所得到的DNA质粒导致更高的质粒产率和更高的质粒稳定性，推测是由于减少的KanaR表达。有利地，DNA质粒可以是pLL10或pLL14。

本发明还涉及可以包含卡那霉素抗性基因的DNA质粒，其中将转座子插入在KanaR启动子和翻译起始之间，从而导致减少的KanaR表达。所得到的DNA质粒导致更高的质粒产率和更高的质粒稳定性，推测是由于减少的KanaR表达。

本发明包含用于递送和表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽的制剂，其中制剂可以包含本文公开的任何DNA质粒和药学或兽医学上可接受的载体、媒介物或赋形剂。在一个有利的实施方案中，载体、媒介物或赋形剂可以促进载体或蛋白质的转染和/或改善载体或蛋白质的保存。有利地，目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽可以衍生自禽类、牛、犬、马、猫或猪病毒或病原体。

本发明进一步提供了在动物中刺激免疫应答的方法，其可以包括给动物的细胞施用有效量的本文公开的制剂，并且在细胞中表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。本发明还提供了在动物中引发免疫应答的方法，其可以包括给动物的细胞施用有效量的本文公开的制剂，并且在细胞中表达目的抗原、表位、免疫原、肽或多肽。有利地，动物可以是禽类、牛、犬、马、猫或猪。