[发明专利]从大肠杆菌BL21CCM7394中无色菌CCM4824制备固定重组青霉素酰化酶催化剂的方法及其在合成β-内酰胺抗生素中的应用

权利要求书

1.一种利用青霉素酰化酶作为生物催化剂合成β-内酰胺抗生素的方法，其中 所述的青霉素酰化酶生物催化剂是来自于无色菌CCM4824并由大肠杆菌BL21 CCM7394中表达，在其特征在于包括：

a、利用溶剂和化学清洁剂或金属螯合物来增加细胞的通透性，从而以化 学方法提取青霉素酰化酶；

b、用分级沉淀和层析对可溶性酶进行纯化；

c、在-2到2℃的温度下，利用重量比率范围为15：1到20：1的丙烯酰胺 和N,N’-二甲基乙二胺对纯化后的酶进行固定化；

d、通过与戊二醛交联稳定固定化酶，以获得粒子尺寸在100到300微米的 粗粒子；

e、利用所得的固定青霉素酰化酶与活性酰基原料酶促酰化亲核试剂，以 获得具有较高产量和纯度的β-内酰胺抗生素；

所述的溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯；所述的化学清洁剂或金属 螯合物选自EDTA、溴棕三甲铵、尿素和十二烷基硫酸钠；所述的活性酰基原 料选自D-对羟基苯甘氨酸甲酯或D-对羟基苯甘氨酸酰胺，或是D-苯甘氨酸甲酯 或D-苯甘氨酸酰胺；所述的亲核试剂选自6-氨基青霉烷酸或7-氨基去乙酰氧基 头孢烷酸。

2.一种利用青霉素酰化酶作为生物催化剂合成β-内酰胺抗生素的方 法，其中所述的青霉素酰化酶生物催化剂是来自于无色菌CCM4824并由大肠杆 菌BL21CCM7394中表达，在其特征在于包括：

a、利用溶剂和化学清洁剂或金属螯合物来增加细胞的通透性，从而以化 学方法提取青霉素酰化酶；

b、用分级沉淀和层析对可溶性酶进行纯化；

c、在-2到2℃的温度下，利用重量比率范围为15∶1到20∶1的丙烯酰胺和 N，N’-二甲基乙二胺对纯化后的酶进行固定化；

d、通过与戊二醛交联稳定固定化酶，以获得粒子尺寸在100到300微米的 粗粒子；

e、利用所得的固定青霉素酰化酶与活性酰基原料酶促酰化亲核试剂，以 获得具有较高产量和纯度的β-内酰胺抗生素；

所述的溶剂选自甲苯、乙酸乙酯、氯仿和丁酯；所述的化学清洁剂或金属 螯合物选自EDTA、溴棕三甲铵、尿素和十二烷基硫酸钠；所述β-内酰胺抗生 素是阿莫西林，所述的活性酰基原料是D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐酸盐，所述的 亲核试剂是6-氨基青霉烷酸，其中6-氨基青霉烷酸与D-对羟基苯甘氨酸甲酯盐 酸盐的摩尔比率范围为1.2到4.5。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，6-氨基青霉烷酸与D-对羟基苯甘氨 酸甲酯盐酸盐的摩尔比率范围为1.5到1.8之间。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的β-内酰胺抗生素是氨比西 林，该抗生素由6-氨基青霉烷酸与D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中6-氨基青霉 烷酸与D-苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，6-氨基青霉烷酸与D-苯甘氨酸甲酯 的摩尔比率范围为1.3到1.7之间。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的β-内酰胺抗生素是头孢氨 苄，该抗生素由7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸和D-苯甘氨酸甲酯酰化合成，其中 7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸与D-苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.2到4.5。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述的，7-氨基去乙酰氧基头孢烷酸 与D-苯甘氨酸甲酯的摩尔比率范围为1.5到1.7之间。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的粒子尺寸为150到250微米之 间。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的化学提取是利用1到3%v/v氯 仿和0.1到0.2%w/v十二烷基硫酸钠的混合物。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的提取时的温度为15到35℃、 提取6到12小时。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于所述的提取是在28到30℃的温度下 提取6到12小时。