[发明专利]用新融合配偶体生产重组蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及用新融合配偶体生产重组蛋白的新方法。 

背景技术

随着遗传重组新技术的出现，生物学有用蛋白质已经使用原核(大肠杆菌(Escherichia coli))、酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))和高等生物细胞生产。这些重组蛋白广泛用于生物技术工业作为治疗剂和其它各种目的的生物制品。特别地，大肠杆菌是最优选的宿主细胞用于重组蛋白生产，因为其生长速率快以及分子生物学熟知。 

鉴于成本、设备及方法操作，使用大肠杆菌的蛋白质生产系统具有优异的经济效率，但是其具有一主要问题，其中大部分外来蛋白质在细胞内作为无活性包涵体(IB)产生，需要重折叠过程以获得活性折叠结构。为了从IB获得活性形式，IB应该在高浓度盐酸胍(GdnHCl)或尿素中溶解，然后用例如稀释等方法重折叠成天然结构。重折叠机制不很清楚，每种蛋白的重折叠方法依赖于蛋白本身的固有和独特特征。这个固有问题是低产量、高生产成本和长时间的原因(Lilie，H.et al.(1998)Curr.Opin.Biotechnol.9，497-501)，很难或者不能重折叠大部分高分子量蛋白，其是工业化应用蛋白的障碍。 

IB形成特征在于分子内折叠速率和分子间聚集的竞争。当分子内折叠速率慢于分子间聚集速率时，形成IB形式的聚集体(Mitraki，A.&King，J.(1989)Bio/Technology 7，690-697)。 

本发明使用30％或更高比率负电荷的特异肽序列作为融合配偶体以防止形成聚集体，因此获得正确折叠的可溶形式。折叠中间体的聚集由于存在于融合配偶体的负电荷之间的分子间排斥被有效抑制，由此可以实现生产天然蛋白的显著改良。 

当本发明融合配偶体应用于胰岛素生产过程时，IB形成被有效消除，在缓冲溶液中简单氧化后产生天然胰岛素。 

人胰岛素目前在大肠杆菌或酵母中用重组技术生产[Frank，B.H et al.(1981)In：Peptides：Synthesis-Structure-function(ed.Rich，D.H.Gross，E.)pp.729-738，Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.；Thim，L.et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，6766-6770；Markussen，J.et al(1987)Protein Engineering 1，205-213]。 

在大肠杆菌中生产人胰岛素使用胰岛素原(PI)[Frank，B.H et al.(1981)In：Peptides：Synthesis-Structure-function(ed.Rich，D.H.Gross，E.)pp.729-738，Proceedings of the Seventh American Peptide Symposium，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL.]或者小胰岛素原(miniproinsulin，mini-PI)[Chang，S.-G.et al.(1998)Biochem J.329，631-635]作为前体。首先，融合蛋白形式的PI或者mini-PI作为IB产生，然后IB在变性剂如尿素或GdnHCl中溶解。PI或者mini-PI作为磺酸化形式通过溴化氰(CNBr)裂解、磺酸化和纯化步骤从融合蛋白分离。磺酸化PI或者mini-PI重折叠成天然形式，胰岛素通过胰蛋白酶和羧肽酶B处理随后一些纯化步骤而生产。PI或mini-PI的重折叠产量受重折叠蛋白的浓度大大影响，在较高浓度显示较低产量。下游方法包括溶解、CNBr裂解和磺酸化花费大量成本，导致高生产成本。CNBr裂解特别导致50-60％差产量，被认为是需要克服的技术。 

发酵后减少方法步骤的方法是使用酵母细胞，其中在胞外分泌单链胰岛素衍生物后胰岛素通过一系列下游方法生产(酶反应，酸水解，分离和纯化)产生。产量低，但是酵母系统使纯化步骤更容易并且不需要重折叠步骤，这是原核生物中经历的困难方法[Thim，L.et al.(1986)Proc.Natl，Acad.Sci，USA83，6766-6770]。 

因此，组合大肠杆菌高表达水平及消除酵母系统中的困难的重折叠方法是生产胰岛素方法的优异选择。 

发明内容