[发明专利]花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法

说明书

技术领域

本发明属于脂肪酸代谢工程领域，具体涉及一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因及其编码的蛋白质以及克隆方法。

背景技术

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是高等植物、细菌、蓝细菌、绿藻中广泛存在的一种胞质酶(Chollet R，Vidal J，O’Leary MH.Phosphoenolpyruvate carboxylase：a ubiquitous，highly regulatedenzyme in plants[J].Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，1996)，它能催化CO₂和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)形成草酰乙酸(OAA)，是C4植物光合固定CO₂的关键酶。同时，PEPCase在柠檬酸循环、调控细胞内pH值及阳离子平衡等方面也具有重要作用(潘瑞炽，董愚得.植物生理学.第三版[M]北京：高等教育出版社，1995)。1999年，陈锦清等利用PCR技术克隆了油菜PEP基因片段，并构建了带PEP反义基因的双元载体，以利用反义RNA抑制油菜PEP基因表达量，从而使油菜油脂/蛋白质含量比率向高油脂变化。2005年，张银波等利用RT-PCR技术克隆到了油菜PEP基因片段，并构建了对应于PEPCase基因的RNAi载体，以利用RNAi技术抑制油菜PEPCase基因的表达，使代谢流偏向油脂合成，从而提高油菜籽粒中的油脂含量。

2006年，吴关庭等采用根癌农杆菌介导方法将反义磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvatecarboxylase，PEPCase)基因导入粳稻品种秀水11，获得一批转基因植株，T2代测定结果显示，转基因水稻株系的稻米脂肪含量比对照高出0.37±0.12个百分点，其差异大部分达到极显著水平。在反义PEP基因表达技术提出之前，世界上基因工程提高植物种子含油量主要有两条技术途径，一是使外源乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-coenzyme A carboxylase，ACCase)基因在籽粒中表达，从而正向提高脂肪酸生物合成限速酶ACCase活性，通过这一途径，曾将油菜种子含油量提高了5％(Roesler K，Shintani D，Savage L，Boddupalli S，Ohlrogge J.Targeting of the Arabidopsis homomericacetyl-coenzyme a carboxylasetoplastidsofrapeseeds.PlantPhysiol，1997)。二是导入酵母溶血磷脂酸酰基转移酶(lysophosphatidic acidacyltransferase，LPAAT)基因，提高脂肪酸合成酯类的速度，减轻脂肪酸合成中的反馈抑制(Zou J，Katavic V，Giblin EM，et al.Modificationof seed oil content and acyl composition in the Brassicaceae byexpressionofayeastsn-2acyl-transferasegene.PlantCell，1997)。目前应用的反义PEP基因表达技术是在油脂生物合成的上游对该代谢途径进行调控，即通过反义抑制PEPCase活性，将更多的碳源用于脂肪酸合成，提高种子含油量。

花生籽仁含有50％左右的脂肪和24％～36％的蛋白质。研究表明，花生脂肪含量与蛋白质含量呈极显著负相关(廖小妹等.珍珠豆型花生脂肪蛋白质含量与农艺性状相关与通径分析.莱西：花生科技，1992)。80年代末，日本学者杉本博士发现籽粒蛋白质含量与丙酮酸羧化酶(PEPCase)活性密切相关(陈锦清，黄锐之，郎春秀等.油菜PEP基因的克隆及PEP反义基因的构建.浙江大学学报，1999)。本发明首次从花生中分离克隆了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)，并研究了不同脂肪含量的花生品种间该基因的表达差异，提出利用AhPEPC的基因工程来提高花生油份含量的方法。

发明内容

本发明的目的在于公开一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(AhPEPC)的核苷酸序列。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是调控花生籽粒蛋白质/油脂含量比例的关键酶，该酶活性的降低可使花生中脂肪含量增加。

本发明的第二个目的还提供一种花生磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码的蛋白质。

同时，本发明还要提供该磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的克隆方法。