[发明专利]流感全病毒减活疫苗重组体、其构建方法及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组病毒体毒株，尤其涉及一种流感全病毒减活疫苗冷适应重组体、其构建方法及用途，属于生物制药领域。 

技术背景 

应用减毒流感疫苗进行免疫是模仿流感病毒的自然免疫学原理。它是通过对鼻腔粘膜施用雾化状态适冷型减毒疫苗来实现的，此疫苗诱发血清和粘膜抗体的产生并激活细胞免疫机能，因而其免疫性与自然感染相似。另外鼻腔喷雾给药比注射方式更能增加人们的接受程度。鼻喷式流感全病毒减活疫苗是利用美国密执根大学Maassab博士通过温度适应原理建造的适冷病毒作为疫苗构建的基础，此适冷病毒，在疫苗病毒的构建中又称主供体病毒(MDV)，是将流感病毒在逐渐降低温度的条件下进行了多次传代，从而产生一株可以在25℃下有效、稳定生长的病毒，经过对此原始病毒及其多次和在多种条件下传代所产生的中间体病毒的基因型的分析研究，结果表明其对温度适应的特性是由其编码的遗传基因所决定的，与原始病毒相比，适冷病毒的六条内源基因序列发生了重要的变更，这些变更保证了适冷性病毒能在低温下稳定生长。通常情况下野生型原代病毒的生长在25℃下严重受限，而主供体病毒是适冷型的，即在25℃下能有效生长；主供体病毒也是温度敏感型的，即A型病毒的生长受限温度为39℃，B型病毒的生长受限温度为37℃。因雪貂对流感病毒的反应与人体非常相近，采用雪貂为动物材料所作的动物安全性和免疫原性等实验证实，主供体病毒是在雪貂中为减活的，即此病毒不能在雪貂体内产生常见的人流感症状。由Maassab博士建造的流感A型和B型主供体病毒株是减活基因的稳定供体，可用于构建减活流感侯选疫苗。自1976年以来，美国国家健康研究中心及其它医疗机构对一些适冷型疫苗候选毒株进行了临床研究，在这些临床研究中，一价和二价A型疫苗，一价B型疫苗，以及三价疫苗被施用于8000多人，年龄从2个月到100多岁。 

发明内容

本发明首先所要解决的技术问题是利用现代分子生物学原理和手段，通过最佳的遗传组合，完成病毒学的目标，即产生一种减活的、适冷的、温度敏感的流感病毒疫苗重组体。 

本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的： 

一种减活的、适冷的、温度敏感的流感病毒疫苗重组体(Ca A/Newcaledonia/20/99)，其微生物保藏号是：CGMCC1538；保藏地点是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所；保藏时间：2005年11月17日。 

本发明流感病毒减活疫苗重组体含特定的基因组合，由于流感病毒基因组结构的特异性，即8个基因分别由8个RNA片段编码，在病毒复制过程中，8个基因片段可以自由组合，因而，此疫苗的组成特点为两个表面蛋白基因HA和NA来源于野生型病毒，六个内源病毒基因PB2，PB1，PA，NP，M和NS来源于适冷型病毒，表面抗原基因决定了病毒的抗原性，内源基因决定了病毒的减活与适冷性。 

本发明所要解决的另一技术问题是提供一种制备上述流感病毒重组体的方法。 

本发明所要解决的另一技术问题是通过以下技术途径来实现的： 

一种制备上述流感病毒重组体的方法，包括以下步骤： 

将流感主供体病毒和流感野生致病型病毒混合共感染，筛选病毒重组体、克隆、鉴定即得。 

上述制备方法中，其中，所述的主供体病毒株优选为适冷型的A/Ann Arbor/6/1960或B/Ann Arbor/1/1966(购自MobioHealth公司)；所述的野生致病型病毒株(购自英国NIBSC)优选为：A/New Caledonia/20/1999、A/Wyoming/3/2003和B/Jilin/20/2004。 

将主供体病毒与野生性病毒按5∶1到1∶50(优选为1∶1)的比例混合共感染；共感染的温度为20-33℃，优选为27℃；共感染的时间为20-60小时，优选为24小时；共感染的剂量是每个病毒感染1-0.01细胞，优选为每个病毒感染1个细胞。