[发明专利]人附睾表达的防御素基因及克隆表达与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与医学领域。具体地说，本发明涉及一种人附睾特异表达的防御素基因HEL-75的核甘酸序列和该基因表达蛋白的氨基酸序列，以及该蛋白的制备方法及其在抗感染、抗肿瘤，开发新的避孕药以及辅助诊断和治疗不育症中的生物学应用。

背景技术

哺乳动物防御素是机体的先天免疫因子，它是一类小分子阳离子抗菌肽。根据氨基酸序列、六个半胱氨酸对以及外显子的数目不同分为两大类：α-防御素和β-防御素。α-防御素富含精氨酸，由29-35个氨基酸组成，拥有三对以C1-C6，C2-C4，C3-C5排列的二硫键。它们主要表达于中性白细胞以及潘氏细胞中。到目前为止，总共报道了五种不同的人α-防御素基因和六种α-防御素蛋白。哺乳动物β-防御素也含有大约35个氨基酸的残基，六个半胱氨酸以C1-C5，C2-C4，C3-C6的的方式形成三对与α-防御素不同的二硫键。更有趣的是，与α-防御素在多个组织和细胞类型中表达不同，哺乳动物β-防御素倾向于表达在男性生殖道，特别是附睾和睾丸中的上皮细胞中，它们在组织跟环境之间为机体提供了第一道保护屏障。

最近，通过运用系统的基因组生物信息学方法，从大鼠和人的基因组中分别发现了42和39个β-防御素基因和假基因。它们都在染色体中形成四到五个基因簇。更奇怪的是，RT-PCR分析表明大鼠中除了Defb4(人BD2同源基因)主要表达在呼吸道和上消化道之外，其它全部β-防御素基因都倾向于表达在男性生殖道，特别是附睾跟睾丸中。而且，大多数表达在生殖道中的β-防御素受发育跟雄激素的调控，它们在性成熟过程中表达得到加强。这些特性表明，β-防御素可能在生殖和宿主防御中起双元的作用。

发明内容

发明的目的在于从人附睾cDNA文库(申请号：200510059634.5，公开(公告)号：CN1840544)中克隆出一新HEL-75基因(注册号：EF426755)，提供编码本发明融合蛋白的DNA序列，提供携带编码本发明融合蛋白的DNA序列的重组表达载体，通过生物信息学分析对HEL-75基因进行生物学功能预测，并对其重组表达蛋白进行系统的生物学功能研究。

一、本发明的技术路线

1.基因克隆与序列分析

2.表达载体的构建

3.重组HEL-75蛋白的纯化

4.重组HEL-75蛋白的生物学功能研究

二、具体步骤

1.基因克隆及序列分析

从本研究室构建的青年人附睾cDNA文库中获得一个克隆，运用电子克隆获得了全长基因，命名为HEL-75。经过BLAST比对后发现它与NCBI数据库中编号为NM_207469的基因具有100％的同源性，属于防御素家族成员。利用GENSCAN(http://genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析HEL-75基因结构，染色体定位利用Genome Browser(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)中的BLAT工具进行分析。HEL-75编码蛋白的信号肽切割位点用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测；N-糖基化和磷酸化位点用ProfileScan预测：http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN；系列比对用CLUATAL W分析：http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html。

2.表达载体的构建

根据HEL-75的基因序列，合成一对扩增成熟编码区的特异引物：上游HEL75-F：5’-TTGGTACCGACGACGACGACAAGGGTGGGTCAAAATGTGTG-3，下游：HEL1-R：5’-GGCGAATTCTCATGATGTTACGGTCGTTTGTTGC-3’。上下游分别引进内切酶位点KpnI和EcoRI。以人附睾cDNA文库为模板，通过PCR直接扩增目的基因，然后克隆至克隆载体pGM-Tvector进行测序鉴定。经过测序鉴定后的HEL-75基因通过KpnI和EcoRI位点克隆至表达载体pET32b(+)中，使其与融合标签的阅读框一致。重组表达载体pET32b(+)-hBD32转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞，所得工程菌株经1mM IPTG在32℃诱导4h后，所有组分用15％SDS-PAGE分离，考马思亮兰G-250染色分析工程菌的表达情况。所有的分子克隆实验都按照标准程序进行。