[发明专利]人类附睾特异表达的精子结合蛋白HEL-127的制备与应用

说明书

技术领域：

本发明涉及生物技术和医学领域。本发明提供一种新的人附睾特异表达精子结合蛋白HEL-127，公开了编码HEL-127蛋白的氨基酸序列和编码本蛋白的DNA序列。本发明还公开了该蛋白的制备和检测方法，以及生物学功能。该蛋白对精子成熟、正常受精及早期胚胎发育发挥重要作用。HEL-127蛋白可作为免疫性避孕药的研发，以及男性不育症的临床诊断与治疗的靶蛋白。该蛋白的研发，对男性生殖医学意义重大。

发明背景：

近年育龄夫妇不育症的发生率有不断升高的趋势。世界卫生组织研究结果表明全世界约有5000-8000万人有生育问题，每年新增200万对不育夫妇。在中国，不育率约为11.47％，其中男性不育占33.15％，而且数目在持续上升，研究男性不育症的诊断与治疗，开发安全有效的男性新型避孕药物将成为目前生殖领域的研究热点，附睾作为精子成熟、储存和保护的场所成为男性避孕药的一个作用靶点。

精子发生和精子成熟是个高度程序化的过程，除受到生精细胞自身因素作用外，还部分受到睾丸和附睾微环境的影响。研究显示，精子在附睾的成熟依赖于精子与附睾上皮区域性分泌的蛋白质间的相互作用。附睾上皮合成和分泌的蛋白直接或间接的参与了附睾管腔微环境的形成，这些分泌蛋白对于精子成熟过程中的运动能力的获得可能发挥重要作用。

目前发现动物约有200多种蛋白存在于附睾管腔当中，但是这些分泌蛋白在精子成熟过程中所起的作用还不甚了解。尽管精子成熟的生理机制可以通过与目前已发现的哺乳类动物比较而了解，但是研究显示大部分附睾分泌蛋白具有高度的种属特异性，这制约了从传统的动物模型中获得相关信息的开展。

发明目的：

本发明的目的是提供一种人附睾特异表达蛋白及其片段，变异体或功能等同物。

本发明的另一目的是提供编码这些多肽的基因序列。

本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该蛋白和编码序列的用途。

鉴于上述原因，我们研究中心建立了正常年轻人附睾特异表达的cDNA文库，通过测序获得了一批附睾特异表达的新基因，并对其在精子成熟过程中所起的作用进行研究。目的是了解正常人附睾基因功能，明确精子成熟异常所引起的不孕症的发病机制，提供临床分子诊断和治疗的理论依据，也为研究开发一些阻断精子成熟的男性避孕药物提供新的设计思路。

HEL-127(GENE BANK登录号EF426753)是从我们构建的正常青年人附睾cDNA文库中筛选出的人类附睾特异表达基因。核酸序列及氨基酸序列分析显示，该基因编码一段9kD的分泌蛋白与目前已知蛋白无同源性，与其相关研究目前还未见报告。本研究对HEL-127进行了系统生物学研究，并获得了高纯度具有活性的人附睾特异表达HEL-127重组蛋白。该蛋白为附睾管腔内皮细胞特异表达，特异结合在精子赤道后颈部区。HEL-127在不同的年龄附睾组织表达是不同的，与精子的结合能力也是不同的。HEL-127并具有一定的抗菌活性，不参与精卵激活胚胎发育，但可能参与精子的成熟，在宿主防御过程中发挥作用。对HEL-127的研究将为进一步了解人类男性生殖有着重要的意义

发明内容：

应用基因组信息学原理、cDNA文库筛选、DNA序列测定技术、分子克隆、逆转录PCR、蛋白质表达与纯化技术、抗血清制备、免疫组织化学技术、Western blot检测、抗菌活性检测、体外受精等，克隆鉴定编码hHEL-127蛋白的新基因全长cDNA，通过RT-PCR进行组织表达谱和附睾发育阶段表达分析，纯化原核表达的目的蛋白质并免疫小鼠制备抗血清，利用免疫组织化学分析HEL-127蛋白在附睾头、体、尾及精子表面的定位，通过研究蛋白的抗菌活性，抗血清封闭精子后精子的运动及受精情况初步确定HEL-127基因/蛋白的生物学功能。该基因/蛋白达到的技术指标为：

1.HEL-127基因的位于11号染色体上，跨越了2504bp，包含了2内含子和3个外显子(图1)，编码一个相对分子质量为11kD的小分子多肽。氮末端21个氨基酸形成蛋白的信号肽，成熟肽由77个氨基酸组成，等电点为9.19。