[发明专利]一种PCR引物的设计方法及其应用和试剂盒

权利要求书

1.一种HBV DNA、HCV RNA和HIV RNA的PCR引物的设计方法，其特征在于，在设计引物时，使内对照引物的退火温度低于靶序列引物的退火温度，先在高退火温度下扩增并富集靶序列，再在低退火温度下扩增内对照序列，从而通过控制内对照序列的启动扩增时间来避免其对靶序列扩增的抑制，其中内对照序列和靶序列采用相同的引物，并且该引物与靶序列对应的互补区完全匹配，而与内对照对应的互补区5’端完全匹配、但3’端有1-3个碱基不同，其中所述高退火温度为63-68℃，低退火温度为55-62℃； 

其中，所述HBV的序列为：cttgttgctg tacaaaacct tcggacggaa actgcacttg tattcccatc ccatcatcct gggctttcg合成内对照序列为：cttgttgctg ATcTGaacct tcggacggaa actgcacttg tattcccatc ccatcatcct gggctttcg所述HBV的引物和探针、内对照探针序列分别为： 

LBL-HBV01：5’-aggaa cctct atgtt tccct-3’； 

LBL-HBV02：5’-ccact cccat aggaa tcttg-3’； 

LBL-HBV probe01：5’FAM-tgttg ctgta caaaa ccttc gga-NFQ3’； 

LBL-HBV ic probe01：5’ROX-tgttg ctgAT cTGaa ccttc gga-NFQ3’； 

所述HCV的序列为：ccc ccctcccggg agagccatag tggtctgcgg aaccggtgag tacaccggaa ttgccgggaa gactgggtcc tttcttggat aa合成内对照序列为： cc tgttg ctgat ctgaa ccttc gga aaacccactc所述HCV的引物和探针、内对照探针序列分别为： 

LBL-HCV01：5’-cgtacagcct ccaggcc-3’； 

LBL-HCV02：5’-gccgg gcata gagtg ggt-3’； 

LBL-HCV probe01：5’FAM-cccct cccgg gagag ccata g-NFQ3’； 

LBL-HCV ic probe01：5’ROX-tgttg ctgat ctgaa ccttc gga-NFQ3’； 

所述HIV的序列为：cattctggac ataaaacaag ggccaaaaga atcctttaga gactatgtag atcggttcta taaaactcta合成内对照序列为：cc tgttg ctgat ctgaa ccttc gga aaacccactc所述HIV的引物和探针、内对照探针序列分别为： 

LBL-HIV01：5’-aggatgtata gccctattag-3’； 

LBL-HIV02：5’-gaagc ttgct cggct ct-3’； 

LBL-HIV probe01：5’FAM-ttctg gacat aaaac aaggg ccaaa aga-NFQ3’； 

LBL-HIV ic probe01：5’ROX-tgttg ctgat ctgaa ccttc gga-NFQ3’； 

其中斜体加粗部分为引物结合序列。 

2.权利要求1的方法在PCR扩增中应用，其中将PCR的循环参数设为先后两个部分，第一部分是变性、高温退火和延伸，第二部分为变性、低温退火和延伸。 

3.一种应用权利要求1的PCR引物设计方法的PCR扩增试剂盒，其中包括dNTP、Mg²+、Taq DNA聚合酶、Tris-KC1体系、引物和内对照分子。