[发明专利]一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法

权利要求书

1.一种直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在于，该技术的具 体步骤如下：

(1)称取2.0g土壤样品于10ml离心管中，加入5ml pH值为9.5的0.1M磷酸缓冲液， 旋涡振荡5min，在11000r/min条件下离心10min，弃去上清液，按照上述方法 对分离出的土壤再洗涤2次；

(2)向由步骤(1)得到的土壤中加入5ml裂解液后混匀，裂解液的组成为：0.1～0.3M Tris-HCl，0.05～0.15M EDTA，1.0～1.5MNaCl，pH 8.0～8.5，百分比浓度为0.5～1.5％ 的十六烷基三甲胺，然后加入1.5mg蛋白酶K和4g小玻璃珠，在50℃条件下 振荡30min后加入1ml浓度为100g/L的十二烷基硫酸钠溶液，旋涡振荡5min 后在65℃条件下水浴振荡1h，在11000r/min条件下离心10min，收集上清液得 细胞裂解液；

(3)向由步骤(2)得到的细胞裂解液中加入1ml pH值为6.0～6.5浓度为10M的KSCN 溶液，在35℃条件下水浴振荡15min，在11000r/min条件下离心10min，收集 上清液；

(4)将由步骤(3)得到的上清液加入到离心纯化柱上，将离心纯化柱放入离心管中， 在11000r/min条件下离心10min，倒去离心管中的液体，重复这一过程，直至所 有由步骤(3)得到的上清液都经过离心纯化柱纯化；

(5)向经步骤(4)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗涤液，洗涤液的组成为：10ml 4M NaAc与90ml无水乙醇混合后调pH值至7.5，在11000r/min条件下离心5 min，倒去离心管中的液体，重复这一过程1次，即向该离心纯化柱中再次加入 0.7ml洗涤液，然后在11000r/min条件下离心5min，倒去离心管中的液体；

(6)向经步骤(5)处理后的离心纯化柱中加入0.7ml洗脱液，洗脱液的组成为：10～15 mM Tris-HCl，1.0～2.0mM EDTA，pH 8.0，在65℃水浴中放置2min，在11000r/min 条件下离心5min，将离心管中的液体重新加入到该离心纯化柱中，在65℃水浴 中放置2min，在11000r/min条件下离心5min，离心管中液体即为土壤微生物 DNA溶液，在-20℃保存备用。

2.根据权利要求1所述直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步骤(2)中裂解液的组成优选为：0.2M Tris-HCl，0.15M EDTA，1.0MNaCl，pH 8.0，百分比浓度为1.5％的十六烷基三甲胺。

3.根据权利要求1所述直接用于解析微生物群落结构的土壤DNA提取方法，其特征在 于，所述步骤(6)中洗脱液的组成优选为：12mM Tris-HCl，1.0mM EDTA，pH 8.0。