[发明专利]一种提取橡胶树树皮组织全蛋白的方法

说明书

技术领域：

本发明属于植物生物化学领域，涉及一种高效提取橡胶树树皮组织总蛋白的方法。

背景技术：

各种生物材料中全蛋白质和可溶性蛋白的提取方法主要包括TCA-丙酮沉淀法和双乙法，在此基础上，针对特定的样品，由于其性质的特异性，还需要作一些适当的改进，以便能够采取相应的提取方法，获得高质量的蛋白质样品。植物树皮组织由于质地坚硬、蛋白质含量低，加之纤维素以及酚类、色素等杂质含量高，对其进行蛋白质提取存在一定的难度。目前在国内还没有关于植物树皮组织中全蛋白和可溶性蛋白提取方法的研究报道，即便是在国际上，也还没有较理想的树皮蛋白提取方法。

发明内容：

本发明的目的是从橡胶树树皮组织中高效提取总蛋白，用于开展与橡胶树死皮机制、砧穗相互作用和乙烯利等激素刺激相关的蛋白质组学研究。

一种高效提取橡胶树树皮组织中总蛋白的方法，包括树皮样品采集和预处理、蛋白质提取和定量等步骤。其特征是：

1.树皮样品的采集和预处理

选择待采集样品的植株，用锋利的小刀刮去采集部位的树皮周皮，然后将树皮分割为若干小块，划割深度到木质部；用刀片撬起树皮，并用锡箔纸包住，做好标记，然后迅速冰浴或者置液氮中，带回实验室。用刀将树皮切成薄片，-70--80℃保存备用。

2.蛋白质提取

采用改进的三氯醋酸(TCA)-丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)结合双乙法提取植物树皮组织中的总蛋白。具体操作流程为：

(1)将干净研钵、包含10％TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-20℃冰箱预冷；

(2)称取一定量的树皮样品置于液氮中冷却；

(3)用液氮荡洗研钵1-2次，然后将样品置入研钵中，加入样品的质量的0.5％-2％聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)，然后加液氮充分研磨树皮样品(约10-30min)，至细粉末状。将粉末盛装于离心管；

(4)按1∶10-20(w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液1，w是重量，单位为克、v是体积，单位是毫升。蛋白抽提液1的pH＝8.5，配方为：4-7M尿素，0.5-2M试剂A，0.5-2％CHAPS(3-丙磺酸内盐)，0.5-2％两性电解质载体(pH3.5-9.5)，40mM Tris(三羟甲基氨基甲烷)，％均为质量百分比，M为摩尔，mM为毫摩尔。然后加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA(乙二胺四乙酸)，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM。涡旋混匀，冰浴5-10min；

(5)加入二硫苏糖醇(DTT)至终浓度为10mM，超声5min，室温放置1h(或者37℃孵育1h)，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白；

(6)4-10℃，30,000-40,000g离心10-30min，收集上清液；

(7)向上清液中加入相当于5-10倍体积(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度10mM，超声1min，于-20℃下静置2-15h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀A；

(8)沉淀A用冰浴丙酮重悬浮，冰浴丙酮体积是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的终浓度均为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5min；加DTT至终浓度为10mM，摇匀，于-20℃下静置0.5-2h后，4-10℃、30,000-40,000g离心10-30min，弃上清得到沉淀B；

(9)重复步骤8一至两次，得到沉淀C；

(10)取出沉淀C真空干燥或置超净工作台风干(冰浴中)约5-10min，以除尽有机溶剂。所得干粉末置-70--80℃保存备用或接下一步；

(11)按1∶10-20(w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2的pH＝8.5，配方：7-9M尿素，0.5-4％CHAPS，0.5-2％两性电解质载体(pH 3.5-9.5)，40mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至终浓度为1-2mM，涡旋混匀，冰浴5-10min；加DTT至终浓度10mM，超声1-5min，室温放置1-2h(或者37℃孵育1-2h)，其间不断混匀样品，以充分溶解蛋白，4-10℃、30,000g-40,000g离心10-30min，上清为蛋白溶液A；

(12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至终浓度为12％，充分摇匀使TCA溶解，4-10℃放置30min-2h；