[发明专利]用于检测食品中鱼类过敏原的引物和探针

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用核酸扩增技术进行过敏原快速检测的方法，具体是一种鱼类过敏原实时荧光PCR检测用的引物和探针序列。

背景技术

鱼是最常见的食入性过敏原之一。可引起过敏体质者发生荨麻疹、流涕、喷嚏、哮喘、呼吸困难、呕吐、腹痛、腹泻等不同形式的临床症状。病情严重的，可因支气管痉挛、窒息或过敏性休克而死亡。预防和治疗食物过敏反应，最有效的办法就是避免接触相关食物，为此美国、日本、加拿大、欧盟、英国、意大利、荷兰、纽西兰、澳洲等国家，相继制定并实施过敏原标示制度，以保障消费者的饮食安全，维护公众健康。

近年来，国内外研究者对引发过敏反应的鱼类过敏原进行了深入研究。研究表明，小清蛋白是鱼类最主要的过敏原蛋白，95％的鱼类过敏反应，都是由小清蛋白引起的。小清蛋白分子量很小，约为12kD，108-109个氨基酸残基，是一种钙结合蛋白，主要在鱼类的肌肉组织中表达，对热和酶的作用具有较高抗性。小清蛋白具有较高的同源性，是导致过敏体质者对不同鱼种有交叉性过敏反应的主要原因。

食物中潜在过敏原检测，主要采用蛋白检测和DNA检测的方法。两类方法，对于不同食物成品中过敏原的检出和定量检测，各有优、缺点。以DNA为测试对象的方法与以过敏原蛋白本身为测试对象的方法相比，在食物成分复杂的情况下，目标DNA可以有效提取，受食物基质的影响较小；此外，DNA比较稳定，不象蛋白质组成那样受地理条件、季节变化和加工工艺的影响。当前，基于DNA的检测方法中，实时荧光PCR法以其操作简便、灵敏、特异、快速、重复性好、定量准确、全封闭反应等优点，得到研究者的普遍认可，成为检测的重要工具。

目前，国外已有商品化的鱼类过敏原PCR检测试剂盒，但价格昂贵，且检测的鱼种有限，本发明可弥补上述缺陷，完成食品中更多不同来源鱼类过敏原蛋白的检测。

发明内容

本发明的目的是针对鱼类主要过敏原蛋白小清蛋白，设计一组特异性引物和探针，进而建立一种快速检测鱼类过敏原DNA的方法，以克服基于蛋白的检测方法在某些食品检测中的局限性，为鱼类过敏原检测提供有效工具，确保食品标签的一致性和消费者的饮食安全。

本发明的主要原理为：针对保守序列设计一组引物(上游引物：5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′和下游引物：5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′)和一条Taqman-MGB探针(序列为：5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′)。进行核酸检测时，模板DNA经加热至94-95℃一定时间后，DNA双链解离，引物及Taqman-MGB探针与模板特异性结合。MGB探针的5端标记有报告集团，3端有非荧光淬灭集团，同时还连接有MGB修饰集团(Minor Groove Binder)。当探针完整的时候，报告集团所发射的荧光能量被淬灭集团吸收，仪器检测不到信号。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中，遇到与模板结合的探针时，其3′→5′外切核酸酶活性就会将探针切断，报告集团远离淬灭集团，其能量不能被吸收，即产生荧光信号。随着PCR循环的增加，目的片段成指数增长，荧光信号也同步增强，荧光信号的强弱直接反映模板数量。

本发明涉及的鱼类过敏原实时荧光PCR检测用的引物和探针，其序列如下：

(1)上游引物：5′-CAGGACAAGAGTGGCTTCAT-3′；

(2)下游引物：5′-GAAGTTCTGCAGGAACAGCTT-3′；

(3)TaqMan-MGB探针：中间部位有一个简并碱基，序列为：5′-AGGAGGA(T/G)GAGCT-3′；

在应用中，上游引物、下游引物、TaqMan-MGB探针的体积比为：1∶1∶1；

使用上述引物和探针，检测食品中鱼类过敏原的方法，依次包括下列步骤(1)-(3)：

(1)待检样品DNA的提取

DNA提取可采用普通酚-氯仿抽提法或使用DNA提取试剂盒。

(2)鱼类过敏原的实时荧光PCR扩增