[发明专利]一种重组杆状病毒快速筛选方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因克隆表达技术领域，涉及一种重组杆状病毒快速筛选方法，特别是对现有的利用杆状病毒表达系统筛选重组病毒步骤的改进。

背景技术

杆状病毒以NPV为主，病毒粒子呈杆状，外被有囊膜和核衣壳。病毒囊膜内包被一个或多个病毒粒子，成病毒束。核衣壳内包含着单分子环状双链DNA分子，当囊膜病毒进入到中肠细胞后，在中肠碱性条件下，释放出病毒粒子，使病毒在细胞内增殖并传播。

杆状病毒囊膜表面蛋白主要包括gp64、p74、gp41、p25等，这些蛋白在囊膜病毒进入宿主细胞的过程中起着非常重要的作用，当病毒在细胞内复制、重新包装时，这些蛋白被表达于病毒囊膜的表面。

因此，有人利用杆状病毒囊膜蛋白的特点，建立了杆状病毒表面展示系统。杆状病毒表面展示系统以杆状病毒为载体，外源基因片段插入到病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间，与衣壳蛋白融合表达或与特异性的锚定部位结合，加工后信号肽被切除形成的N端融合蛋白或多肽借助杆状病毒稳定地表达并展示于感染细胞或病毒粒子的表面，筛选得到表达有特异肽或蛋白的杆状病毒粒子。

杆状病毒表面展示系统主要是通过在病毒衣壳蛋白gp64插入外源肽，二者融合表达或与特异性的锚定部位结合，在病毒表面进行融合表达而筛选出目的活性肽或蛋白的高等真核生物展示系统。可以用来展示需糖基化、二硫键异构化等翻译后修饰才表现功能活性的复杂真核蛋白及构建多肽文库、抗体库等。

杆状病毒表面展示系统的基础是gp64蛋白。gp64蛋白是出芽型病毒特有的结构蛋白，以同源二聚体、三聚体或四聚体的方式存在于囊膜内、被感染细胞或病毒粒子的表面，介导病毒和细胞的融合及侵染过程。gp64蛋白能够在病毒感染的早期和晚期表达。在出芽病毒吸附内吞入细胞的过程中，作为pH依赖型的膜融合蛋白，gp64与胞饮体膜融合而把病毒核衣壳释放到细胞质中。

杆状病毒表达载体系统(baculovirus expression vector system，BEVS)是一个以杆状病毒为外源基因载体，以和细胞为宿主的表达系统。杆状病毒的杆状衣壳与较大的基因组可以容纳相对较大片段的DNA插入物，可表达来自病毒、细菌、真菌、植物和动物几乎所有的蛋白；而且细胞作为真核细胞能完成外源基因转译后一系列加工修饰，其转译后的加工修饰是赋予外源基因产物生物活性所必需的，而这些加工修饰在大肠杆菌等原核生物表达系统内往往无法完成，所以利用杆状病毒表达载体表达出来的蛋白更近似于天然物质。由于以上优点，杆状病毒表达载体系统已经成为当今基因工程领域四大表达系统之一，在研究基因表达调控、蛋白质结构和功能分析及各种生物活性物质的制备等方面发挥着越来越重要的作用。目前，用BEVS表达的外源基因已达500种以上，并在基因工程生产蛋白质的研究方面存在巨大潜力。

由于杆状病毒基因组太大，很难对它直接进行操作。通常BEVS由转移载体、亲本病毒和重组介质三部分组成，其技术路线分以下几步：先将外源片段克隆到载体质粒中，置于杆状病毒启动子控制之下，上下游各有一段与亲本病毒DNA相匹配的侧翼序列，通常是多角体蛋白基因(PH)或者是p10基因的侧翼非必须序列，转移载体带有能在大肠杆菌中繁殖的复制起点却不能在细胞中复制。构建完成转移载体，然后把转移载体和野生型病毒共转染入细胞，通过同源重组将外源片段插入到病毒基因组而产生重组病毒。由于外源目的基因替换多角体蛋白基因，重组病毒不能形成多角体，从而易与野生型病毒区分开来，可以通过空斑分析来鉴定和纯化重组病毒。

传统的空斑纯化重组病毒的技术是将共转染后的含有重组病毒和野生型病毒的溶液作梯度稀释后，用不同浓度的病毒感染单层培养细胞，温育1h后用低熔点琼脂糖凝胶覆盖，27℃培养4～6天后进行空斑鉴定。重组病毒产生的空斑借助光学显微镜检查加以筛选，并用消毒玻璃毛细管挑取吸出。吸出的含有重组病毒的琼脂块置于少量细胞培养液溶解稀释并用于下次空斑筛选。如此反复筛选，才能得到纯化的重组病毒。从共转染样本中分离重组病毒也可以在96孔塑料板上进行，但是无论哪种方法，由于重组病毒产生的比例很低(通常只有0.1％～1％)，往往是重组病毒和野生型病毒混合在一起，区分野生型有包涵体表型和重组病毒无包涵体表型非常困难，需要训练有素的观察能力和实际经验，即使技术熟练也需要数个月才能完成。