[发明专利]一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术与组织工程领域，特别涉及一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

背景技术

造血干细胞(Hematopoietic stem cells，HSCs)可以广泛应用于基因治疗、肿瘤净化和骨髓移植等临床方面的应用，尤其是造血干细胞移植已成为癌症患者放化疗后造血功能重建的常规方法(Bellantuono，The International Journal ofBiochemistry&Cell Biology，2004，36(4)：607-620；Masson et al.，Stem Cells，2004，22(6)：897-907)。但细胞数量有限极大地限制了其在临床上的应用，解决此问题的有效方法是实施HSCs的体外大规模扩增。尽管造血干细胞移植能够显著地改善癌症患者放化疗之后的生命质量，但绝大多数患者不可避免地要承受短期内严重的嗜中性粒细胞减少症和血小板减少症的痛苦。因此有必要提出新的治疗方案来降低这些并发症的发生。

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)已被证明在体外具有支持造血发生的功能(Jang et al.，Annals of Hematology，2006，85(4)：212-225；Majumdar etal.，Journal of Hematotherapy&Stem Cell Research，2000，9(6)：841-848；Laughlinet al.，New England Journal of Medicine，2001，344(24)：1815-1822)，同时在NOD/SCID小鼠体内实验中，也证明了同时移植HSCs和MSCs能够加速小鼠造血功能的恢复与重建(Bensidhoum et al.，Blood，2004，103(9)：3313-3319)。而对于临床上乳腺癌患者化疗后的造血干细胞移植，联合植入自体MSCs后，同样具有促进造血功能的恢复与重建，同时降低了伴随造血干细胞移植并发症的发病率(Koc et al.，Journal of Clinical Oncology，2000，18(2)：307-316)。另外，MSCs也可作为细胞治疗的种子细胞和基因治疗的载体细胞(Deans and Moseley，Experimental Hematology，2000，28(8)：875-884)。因此，能够在同一个培养体系内同时培养与收获HSCs和MSCs两种干细胞，具有重要的临床应用价值。

然而，HSCs和MSCs分别具有悬浮生长和贴壁生长的特性，体外共同培养这两种干细胞时，必须同时提供悬浮生长环境和赖以粘附生长的表面。微载体与适宜的生物反应器相结合是解决此问题的有效方法。玻璃包被的聚苯乙烯(Glass coated styrene copolymer，GCSC)微载体以其良好的表面贴附特性，在贴壁细胞动态培养方面倍受关注。而旋转壁式生物反应器(Rotating wall vesselbioreactor，RWVB)是近年来发展起来的，能够为细胞提供一个较为均匀的悬浮生长环境，适用于干细胞体外大规模培养与扩增。

Chen等(Chen et al.，Stem Cells，2006，24(9)：2052-2059)利用RWVB，在添加高剂量细胞因子组合的条件下实现了骨髓来源的HSCs和MSCs的共培养，虽然使HSCs与MSCs分别扩增了9倍和29倍，但高剂量的细胞因子组合显然比较昂贵。关于脐血来源的HSCs和MSCs的体外共同培养至今仍未见报道。因此，在不添加血清、只添加细胞因子和滋养层细胞支持的条件下，实现动态悬浮共培养脐带血来源的HSCs和MSCs，并分离、收获这两种干细胞，具有重要的临床价值和经济效益。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种动态悬浮条件下共同培养脐血造血干细胞与间充质干细胞的方法。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1.分离人脐带血单个核细胞。脐带血来自健康产妇足月分娩或足月剖腹产婴儿，每次脐血采集量平均为50～100mL。脐血采集后，按体积比1∶1与PBS混合均匀，用密度为1.077g·mL^-1的Ficoll细胞分离液以2500rpm，25min离心后获得单个核细胞(Mononuclear cells，MNCs)，用IMDM基础培养基1000rpm，5min离心洗涤两次，调整细胞密度备用。