[发明专利]用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白分离纯化系统，具体地说是一种柱切换循环体积排阻色谱分离系统。

背景技术

在生物大分子的分离中，离子交换色谱和体积排阻色谱是最常用的两种分离技术。而体积排阻色谱由于分离条件温和，容易保存生物分子的活性，因此常被用于生物分子的分离与纯化。和其它的分离模式相比，体积排阻色谱被认为是一种分辨率低的液相色谱方法，因此限制了它在生物大分子分离中的应用。为了提高分辨率，通常会采用更长的色谱柱或者使用更细粒径的填料装填的色谱柱，然而柱压太高也使该方法很难付诸于实践。循环体积排阻色谱是一种提高分辨率的液相色谱方法，样品可以在一根色谱柱内进行无数次重复的分离，因此可以说是无限制地增加柱长，从而可以获得很高的分辨率。然而，随着分离时间的增长，谱峰随之展宽，分离开的色谱峰(分子量范围宽的蛋白、核酸等)在多次循环分离后可能还会重叠。

发明内容

为了克服这一缺陷，申请人建立了柱切换循环体积排阻色谱系统，该方法是将预分离开的生物大分子捕集在第二根体积排阻色谱柱上，通过控制阀切换，将分子量相似的生物大分子切入循环系统中分离，得到满意的分离度后，对分离开的组分进行收集。然而，再从捕集柱切出一小部分进行循环分离，依次类推。这种方法适用实际复杂样品的分离纯化，具有更高的使用价值。

本发明的目的在于提供一种以体积排阻色谱为分离模式的生物大分子分离装置，利用该装置可以分离纯化生物大分子，获得更高纯度的生物大分子，同时还构建连续生物大分子多维分析平台。该装置设计简单，分辨率高，分离效果好，实用性强。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种用于生物大分子分离纯化的柱切换循环体积排阻色谱系统，其特征在于：包括液相色谱泵、切换阀、体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B、检测器，它们通过管道以闭合环路的形式相连；

体积排阻色谱柱A一端与进样阀相连、另一端通过一切换阀A分别与体积排阻色谱柱B、检测器相连，进样阀的外端通过泵经三通接头分别与外界的流动相源及检测器出口相连接，

三通接头与检测器的连接管路上设置有切换阀B，检测器通过切换阀B与收集瓶或废液瓶相连。

所述切换阀A为六通阀或十通阀，它分别与体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B和检测器相连。

所述进样阀由定量环与六通阀或十通阀组成，进样阀通过六通阀或十通阀串连于体积排阻色谱柱A与泵的连接管路中；所述检测器为紫外检测器、质谱或其他类型检测器。

泵、进样阀、体积排阻柱A、切换阀A、体积排阻色谱柱B、检测器、切换阀B和三通或四通连接头通过管路依次相连，通过控制切换阀A可以控制进入循环分离系统的生物大分子的数量，控制阀B的切换可以控制生物大分子组分的分离与收集。

具体分析过程如下：在循环分离前，通过阀A使两根体积排阻色谱柱串联在一起。生物大分子样品首先通过体积排阻色谱柱A分离，然后捕集在体积排阻色谱柱B中，当一小部分生物大分子从体积排阻色谱柱B中被洗脱下来时，切换阀A和阀B，此时泵、体积排阻色谱柱A、检测器通过一个三通或四通连接接头形成一个闭合环路中，此时生物大分子样品可以不断地在该系统中分离直至达到满意的分离结果，而其它的样品则被保留在第二根色谱柱中。第一部分生物大分子完成分离后，生物大分子组分被切出系统收集下来。另一小部分生物大分子从第二根色谱柱中切出，进行循环分离，依次类推。

生物大分子经体积排阻色谱柱A、体积排阻色谱柱B依次分离后，通过控制切换阀，相似分子量大小的样品依次从体积排阻色谱柱B上切入循环系统中，并以体积排阻色谱柱A为分离柱进行循环分离，直至达到满意的分离度。

以体积排阻色谱柱A为分离柱，生物大分子样品以循环分离的方式进行分离。体积排阻色谱柱A的柱体积要小于体积排阻色谱柱B。生物大分子以峰切割的方式从体积排阻色谱柱B中进入循环系统。体积排阻色谱柱B具有分离和捕集的双重作用。

本发明所述生物大分子可以为蛋白质或核酸；本发明可以用于生物大分子的分离与纯化，同时可以作为构建连续生物大分子多维分离平台的重要部件。该系统与传统的体积排阻色谱方法相比具有分离能力强，分辨率高等特点，可用于生物大分子样品的分离纯化。同时，该系统在构建连续生物大分子多维分离平台中也具有很好的实用价值。

本发明的有益效果是：

1.该系统采用循环分离的方式，不需要增加柱长或减小粒径，就可以极大提高分辨率，改善分离效果。

2.由于采用体积排阻色谱分离模式，以低盐缓冲溶液为洗脱剂，因此，蛋白在分离纯化后仍然能保持活性。