[发明专利]共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因核酸疫苗的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种生物技术高新科技领域，共表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF3及ORF5双基因核酸疫苗，用于对猪提供针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的免疫保护作用。

(二)背景技术

猪繁殖与呼吸综合征可引起妊娠母猪流产、死产等繁殖障碍和仔猪呼吸道症状。自2006年6月初以来，在我国湖北、湖南、江西、安徽等十几个省份相继出现高致病性PRRSV为主要病原的猪“无名高热综合征”，给我国的养猪业造成了严重的经济损失。猪繁殖与呼吸综合征病毒为单股正链RNA病毒，长约15kb。ORF3编码分子量为40～50ku的糖蛋白GP3，GP3在猪体内并不能刺激产生中和抗体，但它可通过细胞免疫为母猪提供一定的保护；ORF5编码约25ku的糖蛋白GP5，能诱导机体产生中和抗体及特异性细胞免疫。目前用于预防PRRS的弱毒苗和灭活苗已在我国广泛应用，但是猪繁殖与呼吸综合征仍未得到有效控制。核酸疫苗可将病毒保护性抗原的基因以质粒的方式导入动物体，其表达蛋白既可刺激产生体液免疫又可产生细胞免疫，本发明中将PRRSV ORF3及ORF5基因同时插入真核重组表达载体构建的核酸疫苗尚未见报道。

(三)发明内容

本发明的目的是研制一种能够有效控制猪繁殖与呼吸综合征的共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因的核酸疫苗，使猪繁殖与呼吸综合征难以防治的现状得以突破。

本发明的目的是这样实现的：

在哺乳动物真核表达载体的2个多克隆位点中分别插入了PRRSV ORF3及ORF5完整基因，获得共表达PRRSV ORF3及ORF5双基因的核酸疫苗，该核酸疫苗可在哺乳动物细胞中同时表达PRRSV的GP3及GP5蛋白。

上述核酸疫苗通过以下方法构建而成：

1)ORF3及ORF5的扩增

根据PRRSV美洲标准毒株ATCC VR-2332的基因序列，设计了针对PRRSV山东省分离株SD1株ORF3及ORF5的引物，引物序列如下：

ORF3的引物S1：5’-ATCGCTAGCCGCCACCATGGTTAATAGCTGTA-3’

S2：5’-GAGGAATTCAGAAGAATGTAAATAATTCTCATCTG-3’

预期扩增长度为852bp。

ORF5的引物W1：5’-AATCTAGAGCCGCCACCATGTTGGA-3’

W2：5’-GCGCGGCCGCTCACTGGCGTGTAG-3’

预期扩增长度为702bp。

以SD1株的cDNA为模板，通过引物S1及S2扩增ORF3，通过W1及W2扩增ORF5基因。

2)S-W-PIRES真核重组表达载体的构建

将ORF5的PCR产物W片段与pIRES重组质粒经Xba I和Not I双酶切，将ORF5插入pIRES，构建W-pIRES重组质粒。将W-pIRES及ORF3的PCR产物S片段经EcoR I和Nhe I双酶切后，将ORF3的PCR产物S片段插入W-pIRES，构建S-W-PIRES真核重组表达载体。

3)S-W-PIRES真核重组质粒的转染

将S-W-PIRES转染COS1细胞，通过RT-PCR检测ORF3及ORF5的转录情况，通过免疫组化检测目的蛋白的表达情况。上述试验均证明了目的基因的转录及目的蛋白的表达。

4)S-W-PIRES真核重组质粒的动物试验

将S-W-PIRES质粒免疫小鼠及猪，同时设空载体PIRES及生理盐水对照组，检测核酸疫苗免疫后动物体内针对GP3及GP5的ELISA抗体、中和抗体及淋巴细胞增殖反应。上述试验均证明了核酸疫苗S-W-PIRES在动物体内均可刺激产生针对GP3及GP5的抗体，中和抗体效价可达1∶18.4以上，淋巴细胞增殖能力明显高于对照组。

该核酸疫苗首次在哺乳动物细胞真核表达载体中插入了PRRSV ORF3及ORF5基因，突破了PRRSV常规灭活疫苗及弱毒疫苗的局限性，避免了弱毒疫苗使用后毒力返强情况的发生，弥补了灭活疫苗免疫后不能产生细胞免疫的缺陷，又可使针对GP5的抗体优先产生，改变了PRRSV感染后针对GP5的中和抗体产生慢而且产生量少的不足。该核酸疫苗可在动物体内持续不断的产生GP3蛋白及GP5蛋白，使机体不断产生针对两者的体液免疫及细胞免疫，对猪体提供持久的免疫保护力，在PRRS的防控中具有广阔的应用前景。

4、实施例

1)PCR引物设计合成