[发明专利]一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒

权利要求书

1.一种检测高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株专用试剂盒，其特征在于用于临床高致病性猪繁殖与综合症病毒变异株的检测的特异性引物PSX1/PSX2，特异性扩增PRRSV NSP2变异株，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp，制备步骤如下：

1)试剂盒采用的引物为

PSX1：5’-TGGTCCTAACGGTTCGGAAGAAAC-3’

PSX2：5’-GTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT-3’，

退火温度为54.5℃，采用28个循环，扩增变异株预计扩增片段大小为404bp，扩增传统的PRRSV扩增片断为494bp；

2)病料的处理：将病料剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎，用无菌细胞培养液1∶4倍稀释，取病毒悬液-20℃反复冻融3次，8000rpm离心10min，取上清液-80℃保存备用。

3)病毒RNA的提取

①取研磨液300μL加入600μL RNAout，振荡混匀室温静置5min；

②加入200μL氯仿用力颠倒，离心管混匀后静置5min，12000rpm离心10min。

③取上清，加入500μL异丙醇，振荡混匀后，室温放置10min，12000rpm离心10min。

④轻轻弃去上清，加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)吹打溶解，7500rpm离心5min。

⑤弃上清，室温静置5-15min，使RNA沉淀干燥。

⑥加入10μL的DEPC水溶解RNA，用于反转录。

4)反转录

取提取的RNA7μL，Oligo(dT)1μL 70℃作用10min，后于冰上加入5×buffer4μL、dNTP Mixture 3μL、Rnase Inhibitor 1μL、ddH₂O 3μL、M-MLV 1μL，42℃水浴1h。用下游引物PSX2进行反转录。以此合成的eDNA为模板进行PCR反应。

5)聚合酶链式反应(PCR)

10×反应缓冲液                  5.0μL

dNTP(2.5pMol/μL)                    4.0μL

Primer(+)(25pMol/μL)                1.0μL

Primer(-)(25pMol/μL)                1.0μL

MgCl₂(25mMol)                        4.0μL

cDNA                                 5.0μL

Taq DNA聚合酶(5u/μL)                0.5μL

无菌H₂O           加至               50.0μL

6)反应条件为：(1)95℃5min；(2)94℃1min，54.5℃1min，72℃1min，共28个循环(3)72℃5min。PCR扩增产物于-20℃保存。1.6电泳：电压100V电泳40min，取凝胶在含10mg/mL的溴化乙锭(EB)水溶液中染色15min，在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照。