[发明专利]ATL肽的固相合成方法

说明书

技术领域

本发明涉及多肽类药物的制备方法，尤其涉及一种ATL肽(C₈₅H₁₄₁N₂₇O₁₅)的固相法合成方法。属生物技术领域。

背景技术

ATL肽化学名：乙酰-精氨酰-酪氨酰-酪氨酰-精氨酰-色氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰胺(Ac-Arg-Tyr-Tyr-Arg-Trp-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-NH₂)，

化学结构式为：

分子式：C₈₅H₁₄₁N₂₇O₁₅

分子量：1781.24。

ATL肽是在Ac-RYYRWK-NH₂六肽的基础上改构而来的，此六肽是从合成组合化学肽库中被NOP(Nociceptin/orphanin FQ peptide receptor)选择性筛选出来的肽。孤啡肽(nocieeptin或orphanin FQ)是阿片受体样受体(ORL1或LC 132)的内源性配体，在痛觉调节、心血管系统、离子通道、依赖和耐受、学习和记忆等方面具有广泛的生物学活性。ATL肽是利用SIP(Structure inducing probes)技术设计出NOP受体的新型配体，在原六肽的基础上增加了其代谢稳定性。

美国专利US 7,244,701中有合成本品的报道：包括化学合成法和生物重组合成法，生物合成法是近年发展起来的新合成方法，但生物表达技术目前尚不成熟。同时，产品的纯化和产率方面离产业化生产尚有较大距离。报道的化学合成法包括：1，液相合成法(solution phase peptide synthese)，2，基于Merrifield-类型树脂的固相合成，包括Boc/Bzl和Fmoc/tBu策略。3，基于TentaGel Resin(PEG-PS)类型树脂的固相合成，Fmoc/tBu策略。然而，液相合成法存在(1)反应步骤多，路线冗长。(2)中间体不易纯化分离，实际操作中溶剂蒸除难度较大。(3)目前试剂和所用氨基酸侧链保护基的来源和制备难度较大等不足。Merrifield类型树脂为载体，合成保护ATL树脂后，将肽从树脂上切下来所要求的条件比较苛刻，该方法采用HF裂解方式，必须拥有一台HF气体发生装置才能实现裂解，对于大量的肽树脂只能分两次裂解，生产规模受到限制。另外，HF是一种强腐蚀性的气体，一旦泄漏会对人造成极大的伤害。再者，此合成方法将肽从树脂上裂解下来后，抽去HF用稀乙酸抽提，抽提物经冷冻干燥后，生产周期长，成本高。TentaGel Resin(PEG-PS)类型树脂目前成本较高，不适合于大批量的制备和工业化生产。

发明内容

针对上述技术不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种操作简便，单步缩合反应产率高，副产物少，最终粗品纯度高，杂质含量少，总收率高的ATL肽(C₈₅H₁₄₁N₂₇O₁₅)的固相法合成方法。

本发明所述ATL肽固相法合成方法的技术方案是：采用MBHA树脂作为固相载体，首先在该树脂上连接保护赖氨酰基Boc-Lys(2-Cl-Z)，采用Boc保护氨基酸的程序接肽法完成ATL的合成，用乙酸酐对N端进行乙酰化修饰，得到全保护的肽树脂；用哌啶脱除Trp的甲酰基(For)侧链保护基，最后用三氟甲磺酸脱除侧链保护基团，并切割树脂，得到ATL粗肽制品；然后用反相C18填料的高效液相纯化该粗制品，甲醇-水梯度洗脱方法分离纯化，得ATL肽精制产品。

本发明提供的ATL肽固相法合成方法的具体步骤是：

1)以MBHA树脂为固相载体和起始原料，在MBHA树脂上依次进行缩合反应连接保护氨基酸，制备H₂N-Arg(Mts)-Tyr(2-Br-Z)-Tyr(2-Br-Z)-Arg(Mts)-Trp(For)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-Lys(2-Cl-Z)-MBHA树脂

其中所述MBHA树脂的化学结构为：

MBHA树脂可采用市售产品，如天津南开和成科技公司生产的规格为：subst.0.8mmol/g，DVB：1％，Mesh 100～200的MBHA树脂。