[发明专利]一种交叉保护性疫苗抗原及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种交叉保护性疫苗抗原，其特征在于：交叉保护性疫苗抗原由序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列所示。

2.一种按权利要求1所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：

1)质粒pET258构建：将经BglII/NdeI双酶切的质粒pET25回收的104bp片段与经BglII/NdeI双酶切的质粒pET28回收的5.3kb片段用T4DNA连接酶连接，连接液转化入大肠杆菌中并在含氨苄青霉素的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为pET258；

2)质粒pEVQ构建：

a.以哈氏弧菌T4为模板，用引物VHQF5 5’-CATATGGCGCTTCCACTCAGTGTGG-3’，VHQR5 5’-CTCGAGGCGGATAACGAGGTAAACC-3’，进行PCR扩增，产物纯化后与载体pBS-T于室温连接2-8小时，连接混合液转化大肠杆菌后在含氨苄青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pBTQ；

其中所述哈氏弧菌T4保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏编号为：CGMCC No.1985；

b.将步骤a的质粒pBTQ用限制性内切酶NdeI/XhoI双酶切后电泳，回收1.3kb DNA片段，将其与步骤1)的质粒pET258连接，转化入大肠杆菌，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEVQ；

3)质粒pEVQ的诱导表达：将步骤2)的质粒pEVQ转化入大肠杆菌中，在含有Kn的LB培养基上培养18-24小时，筛选转化子即为BL21/pETQ，将BL21/pETQ于含有Kn的LB培养基中过夜培养；而后再将培养液加入到新鲜的含有Kn的LB液体培养基中，于37℃摇动培养至OD600为0.6，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，37℃继续摇动培养4-5小时，裂解菌体，离心收集上清，纯化重组蛋白，即为由序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序列组成的重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。

3.按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述步骤2)中PCR条件为：94℃60s预变性模板DNA，然后94℃40s，58℃60s，72℃60s，5个循环后改为94℃40s，65℃60s，72℃60s，25个循环后再在72℃延伸反应7-10min。

4.按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述步骤2)含氨苄青霉素、Xgal、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的LB培养基中含有100μg/ml氨苄青霉素、40μg/ml Xgal和24μg/ml异丙基-β-D-硫代半乳糖苷。 

5.按权利要求2所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述步骤3)中纯化重组蛋白过程为将离心收集上清裂解液于聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶，用0.1M的KCl染色直至胶块上现出透明条带为止，将透明区域切割置于含有6ml蛋白电泳缓冲液的透析袋中，120伏电压进行蛋白质水平电泳2小时，取出透析袋放入1000ml PBS中于4℃进行透析三次，透析完毕后将透析袋取出吸出溶液，而后超滤管离心，收集上清液即为重组交叉保护性疫苗抗原VhdQ。

6.按权利要求5所述的交叉保护性疫苗抗原制备方法，其特征在于：所述透析袋放入预冷的PBS中透析时，每5小时后换一次PBS；超滤管离心条件为6000g，4℃下离心10-20min。