[发明专利]栉孔扇贝G－型溶菌酶基因多态性标记筛选及其辅助育种方法

说明书

技术领域：

本发明属于水产生物技术领域中的贝类分子标记辅助育种技术，是一种能在贝类抗病品种培育中应用的贝类抗病相关基因标记及其辅助育种方法。

背景技术：

我国的扇贝养殖业在经过最初阶段的蓬勃发展以后，逐渐暴露出了许多亟待解决的问题。长期的近亲繁育、累代养殖导致了近交衰退，使得栉孔扇贝生长缓慢、抗逆性降低。再加上病害肆虐、环境恶化等因素，扇贝养殖业经常发生大规模死亡事件，造成巨大经济损失。因此，加快育种核心前沿技术的研究和抗逆优良品种的选育已成为保障扇贝养殖业持续发展的关键。但由于目前国内外对贝类抗病机理及抗病功能基因的研究较少，缺乏抗病相关的分子标记，导致贝类抗病品种培育的研究进展缓慢，很大程度上制约了扇贝养殖业稳定、健康和可持续发展。

贝类机体免疫防御反应分为细胞免疫和体液免疫。参与体液免疫的因子很多，溶菌酶是其中十分重要的一员。溶菌酶是一类具有杀菌作用和免疫功能的效应分子，在机体的天然免疫中发挥重要作用(Cheng andRodrick，1975)。自1999年报道了第一种贝类溶菌酶基因序列后，先后从冰岛扇贝、贻贝、美洲牡蛎和栉孔扇贝等贝类中获得了溶菌酶基因的全长序列。研究表明，溶菌酶具有广谱的抗菌效应，参与机体多种免疫反应，能改善和增强巨噬细胞的吞噬能力和消化功能(Biggar et al.，1977)；并在溶菌过程中形成一个水解体系，破坏和消除侵入体内的异物，从而实现机体的免疫防御(Cheng and Rodrick，1975；Chenget al.，1975)。研究还发现，溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用形成复合物，使侵入体内的病毒失活。此外，溶菌酶可诱导调节机体其它免疫因子的合成与分泌，协同其它免疫因子(抗菌肽等)进行免疫防御(Chalk et al.，1994；Patrzykat et al.，2001)。对于缺少特异性免疫的无脊椎动物来说，溶菌酶是其免疫体系中非常重要的一个环节(Lee，2000；Sotelo-Mundo，2003)；而对于水生无脊椎动物而言，由于其生存环境中富含各种各样的潜在病原，溶菌酶的免疫防御功能就显得尤为重要。目前研究表明，在鱼类、昆虫等多种物种中溶菌酶表达水平的升高与免疫力的增强密切相关(Caipang CM，2007；Cheng AC，2008)，但其多态性与贝类抗病力强弱之间的关系研究仍未见报道。

发明内容：

本发明的目的是筛选出栉孔扇贝抗病相关的G-型溶菌酶基因标记，建立相应的栉孔扇贝分子标记辅助育种方法，为栉孔扇贝抗病品种培育提供基因标记和技术方法。

本发明的技术内容为：一、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，包括：1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛查；二、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记辅助育种方法。

一、栉孔扇贝抗病相关G-型溶菌酶基因标记，包括：1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆；2、抗病群体和敏感群体的制备；3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选；4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛查。

1、栉孔扇贝G-型溶菌酶基因启动区部分序列的克隆：参照分子克隆所述方法从栉孔扇贝闭壳肌中提取总DNA；根据已知的G-型溶菌酶基因序列在其启动子区设计引物，克隆得到一段762碱基的DNA序列，连入T载体后进行测序，获得其核苷酸序列。

2、抗病群体和敏感群体的制备：采用人工感染途径获得抗病群体和敏感群体；即从不同海区和养殖场收集扇贝个体之后，用病原菌浸泡感染，根据死亡时间判断对病原菌感染抵抗能力，将扇贝分为抗病群体和敏感群体。

3、抗病相关G-型溶菌酶基因标记的筛选：对5个个体的10个克隆进行了测序，发现了10处多态性位点；PCR扩增42个敏感个体和40个抗病个体的G-型溶菌酶启动区序列后，针对-754TATCTCGATCAGG插入/缺失(I/D)及-391A/G转换分别选用Taq I和Hap II对PCR产物进行酶切，聚丙烯酰胺凝胶电泳后，各发现两种基因型，-754II，-754ID，-391AA和-391AG；其中-754ID和-754II个体在抗病群体和敏感群体中出现的频率无显著差异，而-391AA个体在敏感群体中出现的频率显著高于抗病群体，-391AG个体在抗病群体中出现的频率显著高于敏感群体。因此，-391AA被认为是疾病敏感相关的G-型溶菌酶基因标记，而-391AG被认为是抗病相关的G-型溶菌酶基因标记。

4、携带抗病相关基因标记个体的快速筛查：