[发明专利]植物内生真菌球毛壳菌ND35产生抗生物质的制备方法

说明书

(一)发明领域

本发明涉及植物内生真菌球毛壳菌ND35产生抗生物质的制备方法。

(二)背景技术

近年来，由于栽培品种的单一化和复种指数的提高，由病原物引起的植物病害日趋严重，每年都给农业生产造成相当大的损失。一般地，化学农药能有效地保护植物，但是过量地使用化学农药不仅提高了病原物的抗药性，而且造成环境污染和影响人类健康。公众关心的化学农药对环境和人类健康的有害影响及病原物已经发展的抗药性促进了对一种比较安全的防治方法的研究。生物防治是一种环境友好的和对化学农药有效补充或替代的管理措施。因此生物防治作为有发展前途的防治方法已经受到了特别的关注。寻求高效、安全、持久的防治植物病害的方法是当务之急。

利用微生物活体菌剂防治植物病害是传统的生防技术之一，虽然取得了一定的效果，但田间应用往往由于各种环境因素的影响而导致防病效果不稳定。实践已经证明，从生防菌的发酵培养液中提取制备抗生素制剂，具有较好的生防效果和良好稳定性。如已经开发成功的井岗霉素是我国抗生素中产量和用量最大的品种。多用于防治水稻纹枯病、稻曲病。蔬菜上多用于蔬菜苗期立枯病和白绢等。也可用于防治小麦纹枯病。制剂有井冈霉素水溶性粉剂、水剂、粉剂。另外，对人畜低毒，对鱼类、蜜蜂安全。

从健康毛白杨上分离的植物内生真菌优势种球毛壳Chaetomium globosumND35＝螺旋毛壳C.spirale ND35，在离体对峙培养和次生代谢产物的抑菌试验中，表现出对20多种土传、种传和气传的植物病原真菌有不同程度的抑制作用，其作用机制除了对一些植物病原菌的重寄生作用外，更主要是抗生作用。植物内生真菌球毛壳具有广谱拮抗性和较强抗逆性，在温室显示出对番茄、菜豆灰霉病的诱导抗病作用，在田间生防试验中也显示对黄瓜腐霉根腐病、玉米弯孢霉叶斑病和苹果树腐烂病有良好的防治效果。试验已经证明，植物内生真菌球毛壳菌ND35产生的抗生物质粗提物比单一成分的次生代谢产物，能更有效地防治多种植物真菌病害，并且在高温和酸性环境条件下比较稳定，显示了其生防潜能。因此，开发利用毛壳抗生物质防治植物病害是提高防效和稳定性的可靠方法。

(三)发明内容

本发明的目的是通过发酵培养和化学萃取的方法获得植物内生真菌球毛壳菌ND35产生的具有广谱抑菌活性的抗生物质，用于植物病害的生物防治。

本发明的关键技术与过程是将新鲜的植物内生真菌球毛壳菌ND35的纯培养物-菌丝饼接种到玉米粉或马铃薯蔗糖液体培养基中，在28℃条件下，以160转/分钟，振荡培养15天。发酵液用双层纱布过滤掉菌丝，然后在20℃条件下，8000转/分钟，离心15分钟，取上清液得到培养过滤液。培养过滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次。萃取液经无水硫酸钠干燥后，再用滤纸过滤。再在30℃下，140转/分钟旋转蒸发，用少量丙酮回溶收集，待丙酮挥发后，制得黄褐色固体抗生物质。

本发明开发制备了植物内生真菌球毛壳ND35产生的抗生物质，经测试该抗生物质具有高效和广谱抗真菌活性，对20余种植物病原真菌有抑制作用，可用于土传真菌病害、林果枝干真菌病害、园艺蔬菜病害和大田作物病害的生物防治。

(四)附图说明

图1：植物内生真菌球毛壳菌ND35产生抗生物质的制备方法

图中1是将保存的植物内生真菌球毛壳菌ND35菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，28℃培养5天；2是将新培养的球毛壳菌ND35的菌丝饼接种到玉米粉或马铃薯蔗糖液体培养基中，在28℃条件下，以160转/分钟，振荡培养15天；3是发酵液用双层纱布过滤掉菌丝和培养基残渣，在20℃下，8000转/分钟，离心15分钟，取上清液得到培养过滤液；4是培养过滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液经无水硫酸钠干燥后，再用滤纸过滤。5是在30℃下，140转/分钟，抽气减压旋转蒸发，用少量丙酮回溶收集，待丙酮挥发后，制得植物内生真菌球毛壳菌ND35产生的黄褐色固体抗生物质。

(五)最佳实施方式

菌种准备(1)无菌操作将保存的植物内生真菌球毛壳菌ND35菌种接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，28℃培养5天，可见浓密的毛壳菌气生菌丝长满平板。

液体发酵培养(2)在无菌条件下，用直径为5毫米的打孔器打取菌饼，接种于玉米粉或马铃薯蔗糖液体培养基中。28℃条件下，以160转/分钟，振荡培养15天。

过滤和离心(3)发酵液用双层纱布过滤掉菌丝和培养基残渣后，于20℃条件下，8000转/分钟，离心15分钟，取上清液得到培养过滤液。