[发明专利]冻干蛋白质复性法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种蛋白质复性方法，应用于生物蛋白质工程，尤其是细菌包涵体蛋白工程，分子生物学下游研究，基因工程和蛋白质技术研究，生物制药等领域。

背景技术：

蛋白质复性是生物领域居于核心的中心法则中由无活性肽链一级结构向有活性的蛋白质三级或四级结构演变的质变过程，无论理论和实践意义均极其重大。随着分子生物学和基因工程蛋白质技术的迅猛发展，越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床，科研和工业生产提供一些蛋白质多肽产品。迄今为止，细菌以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，成为生产重组蛋白的首选表达系统，尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰(如糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白。但是80％以上细菌中表达的蛋白质通常以包涵体的形式沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物，如何高效成功地复性蛋白是基因工程蛋白质生产过程中最关键和最困难的一步，已成为科研和生物制药产业化工作的瓶颈步骤。

目前的蛋白复性，主要有三种方式：稀释，层析，透析。这三种的从本质角度讲都是一样的，即利用蛋白质的活性状态是蛋白结构分子能级最低这个原理，平缓的降低变性盐的浓度，进而引起肽链自身内部的结构自动重排，达到复性的目的。但是由于分子热运动，肽链的聚集几乎无法避免，而一旦聚集沉淀，复性即宣告失败。层析法的要求高，柱料相对昂贵，通量低，条件较为苛刻，还有柱料选择也是较复杂的问题。透析的方法虽然可以获得较高的产物浓度，但是容易产生沉淀。稀释法是目前科研应用最多的，就是用复性液逐渐稀释的方法。现在的优化多半是改变兑进去的复性液的配方，来提高复性率，但是无法避免的是样品的过度稀释。

发明内容：

本发明的任务是提供一种简单易行，低成本，无污染，高效率的蛋白质复性方法。解决生物中心法则的瓶颈问题。

冻干蛋白复性法是基于溶液冻结过程中，溶质自然与溶剂分离的自然现象。溶液中溶质盐的溶解度会受到温度的影响，由于变性盐(尿素，盐酸胍等)在低温下溶解度下降逐渐结晶析出脱离溶液，同时做到了减低分子热运动和减低溶液变性盐浓度这两个至关重要的变性因素。结晶的速度可以通过温度的下降速度来进行控制，从而营造了一个蛋白复性的绝好的条件-即低温，和平滑的变性盐浓度下降梯度。同时也可在复性液中辅助以一定浓度的防冻剂(DMSO，海藻糖，葡萄糖等)和复性促进剂(环糊精，甘氨酸，分子伴侣等)，氧化还原剂，缓冲盐等，用于防止冻结对蛋白质活性的损伤，提高复性率。当冻结完成后经冷冻干燥机干燥，获得的固体颗粒。颗粒物利用变性盐结晶比重、结晶形态与蛋白质干粉不同的区别适度振碎后采用风选、过筛、静电吸附等方法分离获得目的蛋白。

附图说明：

如图所示仅只是本发明的一个实际应用的过程示意。

步骤1是蛋白或包涵体等的变性溶解获得原液的过程。

步骤2是步骤1所得原液按照优化程序冻结的过程。

步骤3是冻结的原液在冷冻干燥机中冻干的过程。

步骤4是采用高压静电吸附分离蛋白质干粉和变性盐的过程。

具体实施方式：

结合附图对本发明作进一步详细说明。步骤1依照优化的生物操作配方用6M盐酸胍或者8M尿素等试剂溶解目的蛋白。步骤2需要针对不同蛋白对温度下降速率，溶液剂量进行相应优化，找到合适的冻结方式。步骤3在冻干真空干燥机中升华掉水份等。步骤4适度振碎冻干后获得的固体颗粒成分，用高压静电吸附方式分离出活性蛋白粉末。