[发明专利]半滑舌鳎雌性特异分子标记及其应用

说明书

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的鱼类分子标记和遗传性别鉴定技术，是一种能在鱼类单性育种中应用的鱼类遗传性别鉴定的分子生物学方法。

背景技术

我国有着丰富的鱼类资源，其中许多鱼类在生长速率上存在着性别差异，例如，罗非鱼雄性比雌性生长快约40％以上，而牙鲆和半滑舌鳎等海水鱼类，雌性个体比雄性个体生长快40％-100％，因此，开展这些鱼类遗传性别检测和性别控制的研究既有重要的科学意义，又有重大的应用潜力和推广前景。

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。尽管近2年来，半滑舌鳎人工育苗技术获得突破，年产半滑舌鳎苗种近百万尾，不过，研究表明半滑舌鳎雌性个体和雄性个体在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大2-3倍(黄海水产研究所，孟田湘等，1988)。由于雄性个体生长过慢，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成，由于难以鉴定半滑舌鳎的遗传性别，严重影响了半滑舌鳎雌核发育和性别控制研究的进行。

有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。采用的主要方法包括RAPD、SSR和AFLP等。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；匈牙利农业生物技术中心的Kovacs等(2000)用RAPD扫描非洲鲶鱼雌雄基因池，找到两个雄性性别相关的RAPD标记，一个(CgaY1)大约2.6kb，另一个(CgaY2)458bp，这是首次从鲶鱼中找到性别特异的DNA标记。美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)用分离集团分析法寻找罗非鱼表型性别相连锁的DNA标记，找到10个与罗非鱼表型性别连锁的微卫星标记。这些标记可以直接用于不同Y染色体等位基因功能的研究和具有一个或者几个Y染色体拷贝的亲鱼的鉴定。英国Stirling大学的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼基因组，找到三个Y染色体连锁(OniY425、OniY38 2、OniY227)和一个X染色体连锁(OniX420)的AFLP标记。目前的研究还只是在某些鱼类找到少数雄性性别相关的分子标记，但还没有找到鱼类雌性性别特异的分子标记。而有关半滑舌鳎性别特异分子标记以及遗传性别鉴定的分子生物学技术，目前国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的，是为了筛选出半滑舌鳎雌性特异分子标记，获得性别特异分子标记的序列，并在半滑舌鳎遗传性别鉴定中进行应用，为半滑舌鳎性别控制和全雌育种研究提供分子标记和技术方法。

本发明的技术方案如下：

研究一种半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选方法，包括半滑舌鳎基因组DNA的提取，基因组DNA的AFLP分析，雌性特异分子标记的筛选，其特征是：

一、半滑舌鳎雌性特异分子标记的筛选，包括：

1、半滑舌鳎基因组DNA的提取；

2、基因组DNA的AFLP分析；

3、雌性特异分子标记的筛选；

二、半滑舌鳎雌性特异分子标记的克隆与序列，包括：

1、半滑舌鳎雌性特异分子标记的回收；

2、雌性特异分子标记的克隆；

3、雌性特异分子标记的序列；

三、半滑舌鳎雌性特异分子标记的应用；包括：

该标记应用于无损伤鉴别半滑舌鳎的遗传性别，具体方法是：

采集待测半滑舌鳎鱼基因组DNA，根据获得的3个半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，分别设计3对特异引物，其引物序列分别为：

CseF136N1(5’-AAGTAACGACACGAAGGG-3’)和

CseF136C1(5’-AACCGAGTGAAATGTGATAG-3’)；

CseF464N1(5’-CACAGCCAGGATGAGGAT-3’)和

CseF464C1(5’-TCAGTTGGAAAACGGAGAA-3’)；

CseF783N1(5’-AGATTCAAGCATGACGGT-3’)和

CseF783C1(5’-GATTTTGGACAGAGGAGC-3’)；

采用其中任意1对雌性特异引物进行PCR扩增，就可以对半滑舌鳎鱼进行遗传性别鉴定；