[发明专利]表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌株

说明书

(一)技术领域：

本发明涉及生物工程，具体地说是一种表达嗜热毛壳菌(Chaetomiumthermophilum)热稳定外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌株Pichia pastoris GS-CBH3-27。

(二)背景技术：

纤维素在自然界储量极其丰富，是第一大可再生资源。纤维素的生物降解是通过纤维素酶实现的。纤维素酶是一个复合酶系，包括内切-β-1，4-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(EG)、β-1，4-纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(CBH)及β-1，4-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)(BG)。这三种酶协同作用，彻底切割β-1，4-糖苷键，使纤维素最终降解为葡萄糖。其中内切-β-1，4-葡聚糖酶是纤维素酶系最主要的成分，它首先作用纤维素，水解纤维素链非结晶区的β-1，4-糖苷键将纤维素链打开，它对整个纤维素的降解起重要的作用。

纤维素酶广泛应用于轻工、医药、环保、食品加工、饮料工业、纺织工业、可再生资源的综合利用等方面，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一。目前国内外纤维素酶主要由嗜温真菌曲霉和木霉生产，但存在菌种产酶量低、活力低、酶稳定性差及成本高等问题，使其纤维素酶的生产和应用受到很大限制。由于热稳定纤维素酶在高温条件下的热稳定，因此具重要应用前景和商业价值。

嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布于土壤中的嗜热真菌。该菌在微晶纤维素为唯一碳源的培养基中50℃条件下可以产生热稳定的纤维素酶，但要使之用于规模化工业生产，还存在一些尚未解决的问题。如嗜热毛壳菌培养条件比较苛刻，高温发酵需要特殊设备，产酶效率低，造成成本增加，因此限制了它的应用。解决这一问题的有效途径是应用分子生物学手段，将嗜热毛壳菌热稳定纤维素酶基因导入酵母中高效表达，利用酵母生长快、易于培养等特点，使热稳定纤维素酶基因在常温和短时间内快速、大量表达，期望达到降低能耗和提高经济效益的目的。

(三)发明内容：

本发明的目的是从嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)获得外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的全长cDNA，命名为cbh3(DQ085790)，嗜热毛壳菌cbh3全长的cDNA为1607bp，包括起始密码子和多聚A尾。开放阅读框(ORF)部分为1356bp，编码451个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行检索，发现属于第7家族糖苷酶，其中6个基序DANWRW、FDVDVS、DLWEEV、GYCDSAQC、MVLVMS和MLWLDS具保守性。

利用获得的嗜热毛壳菌cbh3基因，构建重组表达质粒载体pPIC9K/cbh3，利用电转仪进行电击转化Pichia pastoris GS115，在MD和MM培养基上筛选，经PCR鉴定筛选阳性转化子，G418筛选多拷贝转化子，然后进行甲醇诱导表达，获得表达外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3的毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27。该工程菌株接种于含BMGY培养基中，在30℃250rpm/min摇床培养6d后，外切-β-1，4-葡聚糖酶表达量为1.7mg/mL，分子量为48kDa，酶在60℃保温60min，仍有97％的活性，在70℃保温60min，仍有60％的活性，80℃的半衰期为10min。

该工程菌株GS-CBH3-27能够高效表达(1.7mg/mL)嗜热毛壳菌外切-β-1，4-葡聚糖酶基因cbh3，分泌的外切-β-1，4-葡聚糖酶具较高的热稳定性，能用于植物纤维素的生物降解，有重要的经济价值和社会价值。

(四)附图说明：

图1表达嗜热毛壳菌基因cbh3的毕赤酵母工程菌程序图

图中：是嗜热毛壳菌的分离鉴定

是嗜热毛壳菌外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3的克隆

是基因cbh3表达载体的构建

是表达基因cbh3的酵母工程菌株的构建及筛选

是毕赤酵母Pichia pastoris GS115的诱导表达和活性检测

是表达嗜热毛壳菌基因cbh3毕赤酵母工程菌株GS-CBH3-27的保藏

图2外切-1，4-β-葡聚糖酶基因cbh3PCR产物电泳图谱

泳道1：Marker-DL2000

泳道2：cDNA(ORF)(分子量1356bp)

图3外切-1，4-β-葡聚糖酶CBH3的SDS-PAGE分析

泳道1和8：低分子量蛋白标准