[发明专利]寡核苷酸芯片及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种寡核苷酸芯片及其应用，尤其涉及一种基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片及其在中枢神经系统病原体检测中的应用，属生物芯片和诊断试剂等技术领域。 

背景技术

中枢神经系统感染性疾病是一种由多种病原体引起的严重威胁人类生命健康的病症，该种类型的疾病发病急，诊断困难，致死率高，这就要求对脑脊液中病原体进行快速准确的检测鉴定，以期早期采取有效的针对性治疗措施。由于不同的病原体感染，病变范围、程度相差悬殊，临床表现十分复杂，给诊断带来困难，确诊的主要依据是脑脊液的病原学诊断，长期以来病原体诊断主要依靠形态学检查、脑脊液细菌培养及组织学的方法，但脑脊液中病毒含量甚低，其病毒培养检测不但费时、费力，且敏感性和特异性很差，远远不能满足临床要求。 

生物芯片/微阵列技术是上个世纪末期产生的高通量平行检测技术，它一经产生就显示了极大的优势，寡核苷酸微阵列已经在基因表达和人类疾病的研究中取得了广泛的成果。 

在芯片杂交检测过程中，样品的荧光标记是极其关键的一个步骤，特别是对于RNA样品由于其易于降解造成的引物区的缺失也会增加检测的假阴性率，探索更快速和有效的标记技术将对基因芯片技术的应用和推广具有重要的实用价值。生物素-亲和素系统是七十年代后期发展起来的一种生物反应放大系统，具有很多优越性，通过随机引物掺入标记将生物素插入到靶序列，然后与avidin-cy3反应，可以明显地提高信号强度。然而，在检索的寡核苷酸芯片中，还未见用随机引物的方法对多种引起中枢神经系统疾病的病原体靶序列进行biotin-11-dUTP的同时标记，采用biotin-avidin-cy3信号放大系统提高杂交信号强度，来检测多种中枢神经系统感染的常见病原体的寡核苷酸芯片。 

发明内容

针对现有技术的不足和临床诊断的需要，本发明要解决的问题是提供一种能同时扩增多种能引起中枢神经系统疾病的病原体靶序列并提高标记效率的寡核苷酸芯片及其在中枢神经系统病原体检测中的应用。 

本发明的技术构思是用随机引物的方法对能引起中枢神经系统疾病的多种病原体靶序列进行biotin-11-dUTP的同时标记，并与本发明的70mer长片段寡核苷酸探针制备检测芯片杂交，采用biotin-avidin-cy3信号放大系统提高杂交信号强度，增加标记效率来提高病原体检测的敏感性，实现检测多种引起中枢神经系统疾病的病原体的目的。 

本发明的基于biotin-avidin-cy3反应系统的随机引物PCR扩增标记的寡核苷酸芯片，由基片和阵列涂布于其上的CMV(巨细胞病毒)、HSVI(单纯疱疹病毒I型)、RV(风疹病毒)、EBV(EB病毒)或TB(结核分枝杆菌)病原体探针以及阴性对照、阳性对照、空白对照制成，其特征在于：所述基片是表面醛基化修饰的载玻片；所述病原体探针是 10条70mer的、点样浓度均为10μM的CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、EBV1、EBV2、TB1和TB2探针(每种病原体的探针为两条；探针的5’端合成有一个氨基，6碳臂，15个T)；所述阴性对照为点样浓度为10μM的JEV(乙脑病毒)探针；所述阳性对照为点样浓度为10μM的合成标记探针，探针的序列为NH2-(CH2)6-Poly(dT)15-Tamra；所述空白对照为双蒸水；所述芯片的阵列布局如图1所示；其中：上述CMV-1、CMV-2、HSVI-1、HSVI-2、RV1、RV2、TB1、TB2、EBV1和EBV2探针具体序列为： 

CMV-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15 

CGTCTCACGGTCTCGGGACTGGCCTGGACGCGGTCAGCAGAACCAGTGGAAAGAGCCCGACGTCTACTACA； 

CMV-2：(NH2-CH2)6-Poly(dT)15 

GAGCGGCAGAAACGGGTGGACGACGAGGTGGTGCAGCGTGAGAAACAGCAGCTGAAGGCTTGGGAGGAGA； 

HSVI-1：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15 

GACAAACCCAACCGTCCCGTAGTCCCATCCCCCGATCCCAACAACTCCCCCGCGCGCCCCCCGAGACCAGTC； 

HSVI-2：NH2-(CH2)6-Poly(dT)15