[发明专利]三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术

说明书

技术领域

本发明属于三疣梭子蟹微卫星DNA分子遗传标记技术，具体说是一种三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术。

背景技术

本发明做出之前，国内外在其他蟹类中有相关的研究报道，Pamela C.Jensen等在对邓杰内斯蟹(Cancer magister)的研究中，设计了99个微卫星引物，并对其中的9个进行了合成。在进一步的研究中，依据其扩增产物的多态性情况、等位基因大小和是否易于计数等特点选取了6个引物应用于进一步的研究。利用尼龙膜杂交法，Masatsugu takhano等在锯缘青蟹(正蟳，Scyllaserrata)中发现5个具有可变性的微卫星位点。David Gopurenko等在锯缘青蟹(沙蟳，Scylla paramamosain)的研究中筛选到5个微卫星位点。利用常规方法，E.S Yap等在远海梭子蟹(Portunus pelagicus)中筛选到7个含有二核苷酸重复单元、1个含有四核苷酸重复单元的微卫星位点。O.Puebla等在蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)中筛选出5个微卫星标记。H.S.AN等利用PCR筛选法，在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)基因组富集文库中筛选出9个新的微卫星位点。B.等在中华绒螯蟹中筛选到12个具有高度多态性的微卫星位点。这些重要经济蟹类的微卫星DNA标记的开发，已应用于亲缘关系鉴定、种群多样性研究中。目前在国内，除常玉梅等报道了中华绒螯蟹微卫星DNA的筛选情况外，很少有蟹类微卫星方面的研究报道。至今为止，尚未见有三疣梭子蟹微卫星DNA检测技术方面的报道。

微卫星(microsatellites)或称简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)是指由1～6个核苷酸组成的简单串联重复DNA序列。迄今研究过的所有生物种类中都发现了它的存在，并且分布密度很大。由于微卫星广泛分布于基因组中，具有密度大、多态性丰富、高度杂合且稳定性好、遵循孟德尔分离定律共显性遗传、易于PCR扩增等特点，已成为近年来最引人注目的新型DNA标记，并广泛应用于生物资源的家系谱系认证、基因连锁分析、遗传图谱构建、种质鉴定、种群遗传多样性等许多研究领域。

发明内容

本发明的目的是提出一种三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术，主要利用建立的三疣梭子蟹部分基因组文库中的ptssr17的微卫星DNA序列，使用Oligo(Version 6.31)和Primer Premier(Version 5.00)软件在其核心序列的两端设计相应的PCR引物，将引物序列合成后对三疣梭子蟹的个体进行PCR检测，从而快速地检测三疣梭子蟹每个个体在此微卫星区的遗传变异，获得该引物对三疣梭子蟹在ptssr17序列区的遗传变异图谱，通过该图谱直观地表现出每个个体的基因型。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种三疣梭子蟹ptssr17微卫星DNA标记的检测技术，其特征在于其技术操作程序为：首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr17微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr17核心序列区高度遗传变异的多态性图谱。

提取三疣梭子蟹基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入2μl，反应总体积为25μl。

ptssr17微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-CCGAGTAATCAGCAAGTGTCT-3’，负链3’-ATCCTGTTTCTGTCCTCCCT-5’，使用该引物时的退火温度为54℃。

PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng三疣梭子蟹基因组DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg++2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本发明的引物各0.2μmol/L；加ddH₂O至25μl。使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃40sec，54℃1min，72℃，1min，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。