[发明专利]三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测技术

权利要求书

1.一种三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于其技术操作程序为：首先提取三疣梭子蟹基因组DNA并稀释备用；再利用三疣梭子蟹基因组文库中的ptssr36微卫星核心序列，在其序列两端设计特异性引物；然后使用该引物对三疣梭子蟹不同地理群或三疣梭子蟹群内个体的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶检测；利用产物出现的条带进行分析，确定每个个体的基因型，从而获得三疣梭子蟹在ptssr36核心序列区高度遗传变异的多态性图谱；ptssr36微卫星核心序列的特异性引物序列分别为：正链5’-GGTCTATCAAGGCGTTACAGG-3’，负链3’-GTGGAATCAGTGGAGGAGGAAG-5’，使用该引物时的退火温度为53℃。

2.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于提取三疣梭子蟹基因组DNA，将其稀释为50ng/μl，每个PCR反应中加入2μl，反应总体积为25μl。

3.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于其PCR扩增的加样参数为：每个PCR反应总体积为25μl，包括100ng三疣梭子蟹基因组DNA；10X PCR Buffer，2.5μl；Mg⁺⁺2.0mmol/L；Tag酶1u；dNTP各0.1mmol/L；本技术的引物各0.2μmol/L；加ddH₂O至25μl；使用该引物时设置PCR仪的程序参数为：94℃变性2min；94℃40sec，53℃1min，72℃，1min，25个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

4.按照权利要求1所述的三疣梭子蟹ptssr36微卫星DNA标记的检测方法，其特征在于对PCR产物的检测：将PCR产物在6％的变性聚丙烯酰胺凝胶，12W恒功率电泳1～1.5h进行分离；将胶板通过10％的冰醋酸溶液20min→蒸馏水6min→0.1％的硝酸银溶液25min→3％的碳酸钠溶液显色数分钟，终止反应即可得到三疣梭子蟹在ptssr36基因座位高度遗传变异的多态性图谱。