[发明专利]一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是一种采用整细胞催化法制备腺苷甲硫氨酸的方法。

背景技术

S-腺苷甲硫氨酸(又称S-腺苷蛋氨酸，简称SAM)是甲硫氨酸和三磷酸腺苷相结合的代谢物，广泛存在于动植物和微生物体内，参与40多种生化反应，是人体内一种重要的生理活性物质。主要参与体内激素、神经递质、核酸、蛋白质和磷脂的生物合成和代谢以及抗氧化剂谷胱甘肽的形成，与体内各种解毒过程关系密切，是维护细胞膜正常功能、人体正常代谢和健康不可缺少的重要生命物质。同时SAM作为三种代谢途径(转甲基、转硫基、转氨丙基)的前体，临床上被广泛用于治疗肝病、抑郁症、关节炎等。SAM是双手性物质，有两种异构体：(+)SAM和(-)SAM，在体内只有(-)SAM具有生物活性。

SAM在欧洲一直被用作抑郁症及关节炎的处方治疗药物，后又发现其对肝病具有良好的治疗效果。1999年美国FDA批准其作为食品营养补充剂的形式推广出售。因而市场需求量大大增加。2002年SAM仅在美国销售额就达10亿美元。2000年我国开始进口，每年有1亿多元的销售，市场前景看好。目前国内使用的SAM主要是德国基诺(Knol1)和意大利RADIUM FARMAS.R.L.(IT)两个外资公司的产品，其价格昂贵，不能普及使用(汤亚杰，等.生物技术通报，2007，2：76-81)。我国人口众多，有相当数量的肝病和关节炎患者，且随着城市生活节奏加快和工作压力加大，抑郁症患者明显增多。同时SAM具有副作用小，疗效显著等特点，在我国必将有着巨大的应用前景。

SAM的制备始于20世纪50年代，目前的制备方法主要有化学合成法、发酵法和酶促合成法三种。化学合成法是采用S-腺苷高半胱氨酸和甲基供体(CH₃I)合成SAM，但合成的SAM有(+)和(-)两种构型，只有(-)SAM具有生物活性，合成产物中少量的(+)-SAM难以分离，且存在产率低、反应底物S-腺苷高半胱氨酸价格昂贵和环境污染等问题，现已基本不用。

发酵法是近年来工业化生产SAM的主要途径。在含有一定量的甲硫氨酸(Met)的培养基中进行微生物发酵，在细胞内积累SAM，然后破碎细胞提取精制SAM。但发酵法的缺点是终产物积累量低、原料转化率低、产品生产周期长以及SAM的纯化工艺复杂等，从而导致了腺苷甲硫氨酸的价格居高不下，限制了SAM的广泛生产及应用。

酶促合成法是利用SAM合成酶在体外催化三磷酸腺苷(ATP)和L-Met合成(-)SAM。酶促转化法与化学合成法、发酵法相比，具有底物转化率高、产物积累量高、分离提纯容易、反应周期短及环境友好等优点，因而是较为有效的工业化生产方法。然而SAM合成酶在动物、植物和微生物中含量少、酶活低，且分离纯化困难，因此通过酶促转化法生产SAM受到SAM合成酶活力的限制。基因工程的发展使获得大量高活性的SAM合成酶成为可能，利用DNA重组技术构建高效表达SAM合成酶的基因工程菌，重组菌表达SAM合成酶活性为野生菌的几十倍到上百倍，经初步分离纯化后的游离酶或者固定化酶用于体外SAM的合成。但是在工业化规模上大量破碎重组菌提取SAM合成酶以及对酶进行固定化无疑大大增加了企业生产成本，并且在酶纯化及固定化过程中酶的活性会遭到一定的损失。

发明内容

要解决的技术问题

为了避免现有技术的不足之处，本发明提出一种利用整细胞催化合成腺苷甲硫氨酸的方法，是一种工艺简单、成本低廉且操作简便的整细胞催化ATP和L-Met合成SAM的方法。以解决通过体外酶促转化法生产腺苷甲硫氨酸存在的SAM合成酶提取困难、酶活性损失较大的问题。

技术方案

本发明的技术特征在于包括以下步骤：

(1)发酵培养能大量表达腺苷甲硫氨酸合成酶的细胞，发酵过程中培养液的温度维持在15～38℃；

(2)使用有机溶剂或表面活性剂作为通透剂对用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞进行通透化处理，反应温度维持在10～38℃；

(3)使用经过通透化处理的细胞以L-甲硫氨酸和三磷酸腺苷为原料合成腺苷甲硫氨酸，反应液的温度维持在25～38℃。

在本发明的一个优选例中，用于催化合成腺苷甲硫氨酸的细胞为基因工程重组细胞。所述的基因工程重组细胞为表达野生大肠杆菌K12腺苷甲硫氨酸合成酶基因的重组大肠杆菌，以及表达野生酿酒酵母腺苷甲硫氨酸合成酶2基因的重组毕赤酵母。